摘要：利用报告基因β-半乳糖苷酶，分析了枯草杆菌启动子43及amy的转录活性。结果表明，在基本培养基条件下，启动子43在对数前期开始表现转录活性，随菌量增大活性迅速提高，稳定期逐步平稳；在富营养培养基条件下，启动子43转录活性在对数前期与基本培养基条件下相似，在对数期转录活性增加速率则高于基本培养基条件下的增加速率；启动子43转录活性在E coli和B subtilis体内基本一致。启动子amy在淀粉诱导下转录活性较高，在添加葡萄糖以及无诱导条件下酶活较低。
　　关键词：枯草杆菌；启动子；转录活性；基因表达
　　中图分类号： Q933文献标志码： A
　　文章编号：002-302（204）2-0056-02
　　启动子是实现外源基因高效表达的关键，是表达载体的核心成分，启动子的转录活性分析是表达载体构建工作的重点之一。在枯草杆菌中常见启动子重叠和串连现象，例如RNA聚合酶σ43（σA）和σ37（σB）的识别区在胞嘧啶脱氨酶基因启动子43序列内重叠[2]。σ43负责营养期的基因起始转录，而σ37负责对数晚期和平台期早期的基因起始转录，因而启动子43可在多个时期起始转录，是理想的发酵工程启动子[3- 4]。本研究应用报告基因β-半乳糖苷酶基因（bgaB），分析启动子43及枯草杆菌α-淀粉酶基因启动子amy的转录活性，为进一步开发高效表达系统奠定基础。
　　材料和方法
　　材料
　　[2]菌株B subtilis A747和E coli DH5α购自中国典型培养物保藏中心；质粒pEB-bgaB为笔者所在实验室构建，该质粒为大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体，携带β-半乳糖苷酶基因（bgaB）。限制性核酸内切酶、碱性磷酸酶、T4 DNA连接酶购自romage公司，Taq DNA聚合酶和LA Taq DNA聚合酶购自宝生物公司，质粒提取、DNA回收试剂盒购自杭州维特洁公司。
　　2方法
　　2引物设计根据NCBI数据库中B subtilis基因组上的43和amy序列设计引物，43片段扩增后保留其原有起始密码子（ATG），上下游引物分别为5′-[ZZ（Z]CCGGATCC[ZZ）]TTGTAGAGCTCAGCAT-3′（下划线为BamHⅠ酶切位点）和5′-GG[ZZ（Z]CTGCAG[ZZ）]CATGTGTACATTCCTC-3′（下划线为stⅠ酶切位点）；amy片段扩增后保留了原有信号肽序列，上下游引物分别为5′-AA[ZZ（Z]GGATCC[ZZ）]GCTCATGCCGAGAATAGAC-3′（下划线为BamHⅠ酶切位点）和5′-AT[ZZ（Z]CTGCAG[ZZ）]TTCAGCACTCGCAGCCG-3′（下划线为stⅠ酶切位点）。CR扩增条件：92 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次。
　　22[2]载体构建在载体pEB-bgaB上bgaB 5′端的BamHⅠ[2]和stⅠ酶切位点之间，分别插入经回收并酶切的CR产物43和amy，获得质粒pEB-43-bgaB和pEB-amy-bgaB；载体构建成功后，启动子片段43和amy可起始转录bgaB。载体电转入E coli DH5α后，将感受态细胞涂布在含X-gal平板，挑选8 h内出现明显蓝色菌落，提取质粒，酶切鉴定。挑取单菌落摇菌，测定整个生长时期β-半乳糖苷酶活性。
　　23β-半乳糖苷酶活性测定方法和定义[5]将一定体积菌液离心收集菌体，重悬于700 μL Z-buffer（006 mol/L Na2HO4·7H2O，004 mol/L NaH2O4，00 mol/L KCl，000 mol/L MgSO4·7 H2O和005 mol/L β-巯基乙醇，pH值70），加入0 μL Triton X 00（0%）和溶菌酶0 μL[3]（0 g/L），静止30 min后加入邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONG）200 μL（4 g/L），混匀后置于55 ℃水浴5 min，加入[4]Na2CO3 500 μL（ mol/L）终止反应，离心，取上清并测量其D420 nm。
　　酶活性（U）=[SX（]D420 nm× 000D595 nm×5（min）×V[SX）]（D595 nm为测前菌液吸光度；V为所用菌液的体积，mL）。
　　2结果与分析
　　CR扩增获得的43片段大小在250～500 bp之间，amy片段大小在500～750 bp之间（图），与预计大小相符。
　　在基本培养基（胰蛋白胨%，酵母提取物05%，氯化钠%）条件下，E coli DH5α（pEB-43-bgaB）合成的β-半乳糖苷酶活性在对数前期开始表现，随着菌量增大活性迅速提高，稳定期后逐步平稳，最高可达6 650 U，稳定期后随菌群衰退酶活下降（图2）。在富营养培养基（胰蛋白胨2%，酵母提取物%，氯化钠%）条件下，E coli DH5α（pEB-43-bgaB）[CM（233]合成的 β-半乳糖苷酶活性在对数前期与基本培养基[CM）]

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