摘要：为探索河南省郏县红牛产后子宫内菌群变化规律及各菌种的致病性与耐药性，采集21头产后健康的郏县红牛子宫内容物，进行了细菌计数、生化鉴定、致病性及药敏试验。结果表明，正常分娩后1 d牛子宫内即呈现污染状态，共分离出70株（9种）细菌，产后第8天子宫内细菌数量和种类均达到最大值，分别为（1.88±0.65）×107个/g和79株（9种），随后细菌数量和种类开始减少；产后第36天产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes）未分离到，第43天产吲哚金黄杆菌、乳房链球菌（Streptococcus uberis）、屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）4种细菌未分离到。小鼠致病性试验结果表明，大肠埃希菌（Escherichia coli）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus）对小鼠致病性较强，大肠埃希菌组小鼠腹腔攻毒后24 h内全部死亡，其余组小鼠在腹腔攻毒后2 d内全部死亡。大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌、藤黄微球菌、表皮葡萄球菌、产吲哚金黄杆菌均对阿莫西林和氨苄西林耐药，对环丙沙星、恩诺沙星、强力霉素、氯霉素、头孢他啶均敏感。

　　关键词：郏县红牛；子宫内菌群；致病性；药敏试验

　　中图分类号：S857.2+2；S858.23 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4115-05

　　Intrauterine Flora Changes of Postpartum Cows and Its Pathogenicity

　　HU Wen-ju1，2； SONG Yan-hua3； QIN Jia-chen1； SHI Kui-lin4； YU Wen-hao1；

　　LIU Yuan-zhe1； WANG Xin-zhuang1

　　（1. Henan Agriculture University， Zhengzhou 450002， China；

　　2. Henan Radio & Television University， Zhengzhou， 450008， China；

　　3. Henan Vocational College of Agriculture， Zhongmou 451450， Henan， China；

　　4.Jiaxian Redcow Breeding Center of Pingdingshan City， Pingdingshan 467124， Henan， China）

　　Abstract： To study the flora changes of postpartum cows and the pathogenicity of bacteria and drug resistance， the uterine contents were collected from 21 health postpartum Jiaxian redcows for bacteria counting， biochemical identification， test of pathogenicity and drug resistance. The results showed that the uterus of cows were polluted one day after delivery and 70 strains （9 species） bacteria were isolated. The quantity and species of the bacteria reached the peak value （1.88±0.65×107/g and 79 strains（9 species）， then started falling. Chryseobacterium indologenes were not isolated 36 days after delivery and 43 days after delivery. There were four bacteria including Chryseobacterium indologenes， Streptococcus parauberis， Enterococcus faecium and Corpmbacterium were not isolated. Pathogenicity test showed that E.coli， Bacillus cereus， Micrococcus luteus and Staphylococcus epidermidis had high pathogenicity for mice. The mice in E.coli group died in 24 h after attack test， and in other groups died in 2 d. E.coli， Bacillus cereus， Micrococcus luteus， Staphylococcus epidermidis and Chryseobacterium indologenes were sensitive to ciprofloxacin， enrofloxacin， doxycycline， chloromycetin and ceftazidime but resistant to amoxicillin and ampicillin.

　　Key words： Jiaxian redcow； intrauterine flora； pathogenicity； drug sensitive test

　　随着人工授精技术的普及和规模化养殖业的发展，子宫内膜炎在母牛产科疾病中所占比例越来越大，致使良种母牛的繁殖潜力和生产性能无法充分发挥，给养牛业造成较大的经济损失[1]。研究表明子宫内膜炎是因为大量非致病性微生物侵入子宫后，在子宫内过度繁殖引起的炎症[2]，而产后牛子宫内细菌的动态变化存在一个可预测的短暂规律[3]，因此研究产后牛子宫内菌群的动态变化规律对预防和治疗牛子宫内膜炎有重要的意义。

　　本试验对21头产后健康的河南省郏县红牛不同时期子宫内细菌进行了分离，并对分离出的9种细菌的致病性及耐药性进行了研究，旨在探索郏县红牛产后子宫内菌群变化规律，为临床防治提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 供试材料

　　1.1.1 动物 在河南平顶山地区某牛场选取产期相近的郏县红牛21头，所选牛产程均正常、无胎衣不下，无繁殖障碍性病史，体况良好。昆白系小鼠40只（22～25 g/只），其中雌小鼠18只，雄小鼠22只，均购自河南省实验动物中心。

　　1.1.2 培养基 肉汤A培养基、液体硫乙醇酸盐培养基、血液琼脂基础培养基、胰蛋白胨大豆琼脂、麦康凯琼脂培养基、双抗巧克力琼脂培养基、改良沙氏琼脂培养基、厌氧菌琼脂、MH肉汤均为青岛高科园海博生物技术有限公司产品。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 采集 分别于分娩后第1天（分娩当天记为0 d）、第8天、第15天、第22天、第29天、第36天、第43天进行子宫内容物采集。用0.1%高锰酸钾溶液对奶牛外阴部清洗消毒后，将连接有5 mL注射器的灭菌输精管插入其子宫腔中，回抽子宫内容物。将约2 mL子宫内容物置于事先称重并灭菌的50 mL三角瓶内，再次称重后加入少量灭菌生理盐水，密封后置于含有冰块的采样箱内，3 h内带回实验室进行分离培养及相关检测。

　　1.2.2 细菌计数 通过采样前后三角瓶的质量差，计算出所采集到的子宫内容物质量，然后在三角瓶中加入20 mL灭菌生理盐水，充分摇匀后，继续用灭菌生理盐水定容至50 mL。取出1 mL定容后的液体，以10倍稀释法依次稀释样品6次，每次稀释完后从稀释液中取出0.1 mL放入灭菌的平皿内，立即倒入15 mL 45 ℃左右的1.5%营养琼脂，晃动平皿使其混合均匀，待凝固后置于37 ℃培养箱内培养24 h，选择菌落数在30～300之间的平皿进行计数，每个样品重复3次，取其平均值。细菌计数时排除有明显子宫内膜炎症状的样品。

　　1.2.3 细菌的分离纯化与鉴定 取1 mL定容后的菌液接入肉汤A培养基，37 ℃恒温培养18～24 h后，分别划线接种于血液琼脂培养基、双抗巧克力琼脂培养基、改良沙氏琼脂培养基和厌氧琼脂中继续培养。挑取生长状态不同的单个菌落，革兰氏染色、镜检，根据细菌的染色特性并结合菌落形态和生长特性进行初步判断和分类，然后分别接种到相应的培养基上进行纯化。挑取纯化后的单个菌落采用全自动微生物鉴定及分析系统进行细菌的生化鉴定。

　　1.2.4 致病性试验 将40只昆白系小鼠随机均分成10组。第10组为对照组，其余各组腹腔内分别注射1 mL各种纯化后的细菌悬液（菌液浓度均调整为1.2×108 CFU/mL）。攻毒后注意观察小鼠的精神状态、饮食和死亡情况，及时剖解死亡小鼠，选取心、肝、脾等脏器进行细菌分离鉴定，检验是否与攻毒菌株相一致。

　　1.2.5 药敏试验 将待试菌株制成悬液，用灭菌生理盐水调整比浊度，使其达到0.5麦氏单位，然后用MH肉汤按体积比1∶1 000稀释备用。用菌液将药物按两倍稀释法进行稀释，使每行各孔的药物浓度依次为128、64、32…0 μg/mL，然后将96孔塑料板置于各菌株最佳培养环境下培养18～24 h。以无细菌生长孔内所含抗菌药物的浓度为最低抑菌浓度（MIC）。每株细菌重复测定2次，结果取其平均值。

　　1.2.6 药敏试验结果判定 各菌种对不同药物的耐药、中敏、敏感临界值按照美国临床实验室标准化研究所（CLSI）推荐的数值标准进行判定[4]。药敏试验中未列入CLSI推荐范围的部分抗菌药物，其结果判断参考同类药物标准。

　　2 结果与分析

　　2.1 产后牛子宫内细菌数量的变化

　　牛子宫内细菌计数结果见表1。从表1可以看出，正常分娩后1 d牛子宫内即呈现污染状态，到产后第8天其子宫内细菌数量迅速增加，达到最大值（1.88±0.65）×107个/g，随后细菌数量开始减少，产后第22天平均为（5.66±1.09）×104个/g，产后第29天平均为（2.58±0.47）×103个/g，从产后第29天到产后第43天牛子宫内细菌数量处于缓慢减少的状态。产后第36天有6头牛未检测到细菌存在，产后第43天有5头牛检测到细菌。产后第29天和第36天分别有2头和1头牛出现明显子宫内膜炎症状。

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