6CR产物的克隆及序列测定
　　CR产物的回收与纯化参照TaKaRa DNA Fragment urification Kit试剂盒说明进行，并与 pMD 8-T 载体连接转化于DH5α感受态细胞，用CR法和 XbalⅠ、Hind Ⅲ双酶切法筛选阳性克隆菌株，送大连宝生物生物技术有限公司测序。
　　7ITS序列的生物信息学分析
　　利用Clustal X程序将4种不同植物白粉病菌的ITS序列匹配排列，用MEGA 60软件对序列进行比对分析，基于kimura-2-parameter双参数模型，采用邻近距离法（N法）构建系统进化树以推演系统发生关系，同时，采用bootstrap法，经000次循环检验系统进化树的可靠性。
　　2结果与分析
　　2CR扩增结果
　　[2]由图、图2可见，采用真菌通用引物ITS5和ITS6作为外引物，ITS和ITS4作为内引物，对4种白粉菌基因组DNA进行扩增，均得到600 bp左右的DNA片段。测序结果表明，该片段包括了完整的核糖体内转录间隔区ITS和ITS2序列、部分8S rDNA、全部58S rDNA序列及部分28S rDNA序列。
　　22白粉病菌ITS序列分析和进化树的构建
　　将已测得的序列去掉5′和3′端的载体序列，得到4种白粉菌的ITS序列，用Clustal X软件中Alignment程序对ITS序列进行多重比对，结果由表、图3可见，4种白粉菌部分8 S rDNA、全部58 S rDNA序列和部分28 S rDNA序列非常保守，而内转录间隔区ITS和ITS2序列变化较大。基于ITS序列，利用MEGA 60对4种白粉菌进行系统发育分析和进化树的构建，由图4可见，4种白粉菌形成3个进化距离较远的大分支；寄生在豌豆（CFSZ 559）和田旋花（CFSZ7249）上的白粉菌遗传距离较小，亲缘关系较近，其ITS序列紧密聚在支；寄生在紫花苜蓿（CFSZ7253）上的托罗斯内丝白粉菌和寄生在山桃（CFSZ7257）上的三指单囊白粉菌各自成支，ITS序列分析结果与其在形态学上的分类结果相一致。
　　3结论
　　本研究对来自于内蒙古自治区不同属的4种白粉菌进行ITS序列克隆，已成功克隆出白粉菌的ITS序列包括内转录间隔区ITS和ITS2、部分8S rDNA、全部58S rDNA序列及部分28S rDNA序列。通过序列对比分析发现，部分8S rDNA、全部58S rDNA序列和部分28S rDNA序列核糖体编码区非常保守，适合亲缘关系较远的类群分析[6]，而ITS和ITS2变化较大，可用于亲缘关系较近类群的分析。基于ITS序列比对，利用MEGA 60对4种白粉菌进行系统发育分析和进化树的构建，内蒙古自治区4种白粉菌种属间亲缘关系的结果与传统的形态学分类结果相一致，这表明ITS序列可用于白粉菌属内和属间的亲缘关系和分类分析。
　　本研究获得了一种通过扩增ITS序列进行亲缘关系和分类分析快速而有效的方法，这为内蒙古自治区白粉菌分子系统学的研究和植物白粉病的防治，提供了理论参考和相关依据。
　　[HS2][HT85H]参考文献：[HT8SS]
　　[ZK（#]Braun U，Cook R A Taxonomic manual of the erysiphales（powdery mildews）[M] Utrecht：CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre，202：-707
　　[2]Amano K Host range and geographical distribution of the powdery mildew fungi [M]2nd ed Tokyo：apan Scientific Societies ress，986
　　[3]刘铁志 内蒙古白粉菌志[M] 呼和浩特：内蒙古科学技术出版社，200：-322
　　[4]Takamatsu S，Limkaisang S，Braun U hylogenetic relationships and generic affinity of Uncinula septata inferred from nuclear rDNA sequences Mycoscience，2005，46（）：9-6
　　[5][2]Hirata T，Takamatsu S Nucleotide sequence diversity of rDNA internal transcribed spacers extracted from conidia and cleistothecia of several powdery mildew fungi Mycoscience，996，37（3）：283-288
　　[6]Bruns T D，White T ，Taylor W Fungal molecular systematics Annual Review of Ecology and Systematics，99，22：525-564

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