【摘要】目的：建立以ITS2为靶序列鉴定临床分离丝状真菌的分子生物诊断方法。方法：利用通用引物扩增真菌核糖体转录间隔区2（ITS2），对PCR产物进行测序，在GenBank中对测序结果进行Blastn等分析。结果：9株真菌测序结果与表型鉴定符合，鉴定出7株临床分离丝状真菌。结论：ITS2测序可以作为临床丝状真菌的分子生物学诊断方法之一。

　　【关键词】丝状真菌；内部转录间隔区；测序

　　【中图分类号】R446.5【文献标识码】A【文章编号】1004—7484（2013）11—0043—02

　　随着免疫抑制剂、广谱抗生素的广泛应用以及临床侵入性诊疗技术的广泛开展，临床深部真菌感染病例增多，尤其是丝状真菌引起的感染，对该类疾病的早期诊断对抗真菌治疗效果相当关键[1]。丝状真菌采用传统的形态学检查，需要丰富的经验，而且耗时较长，不利于临床的快速、准确诊断。随着分子生物学技术的飞速发展，人们发现真菌的5.8SrRNA基因和28SrRNA基因具有保守序列，它们之间的ITS2序列为可变区，具有属种差异[2]。本研究建立以ITS2为靶序列鉴定临床分离丝状真菌的分子生物诊断方法。

　　1材料和方法

　　1.1真菌菌株本院微生物室和皮肤科实验室保存的真菌菌株，包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、新生隐球菌。阴性对照为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、人类血细胞基因组。

　　1.2临床分离丝状真菌临床分离7株丝状真菌，标本来源分别是血液3例、眼分泌物2例、耳道脓液2例。

　　1.3DNA模板制备真菌菌株的DNA提取采用TaKaRa公司试剂盒（LysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR）提取。具体步骤如下：①50μlLysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR于灭菌的EP管中。②用灭菌枪头挑取单菌落，置于EP管中搅动几下后取出。③80℃热变性15分钟后，低速离心，取1～5μl裂解后的上清液作为PCR反应的模板。

　　1.4真菌ITS2序列扩增通用引物序列[3]ITS86-F：5'-gtgaatcatcgaatctttgaac-3'，ITS4-R：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'，目的片段194bp～494bp。PCR反应总体积50μl，10×buffer5μl，dNTP终浓度为200μmol/L，上下游引物终浓度分别为0.2μmol/L，DNA模板5μl，TaqDNA聚合酶1.25U，加入灭菌去离子水至50μl。反应条件为94℃预变性10min；94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。取PCR产物5μl，加1μl6×缓冲液上样，1.5%琼脂糖电泳，使用5μlDL1000分子量标准。

　　1.5PCR产物测序及序列分析将PCR产物送华大基因科技公司，对PCR产物纯化后测序，测序引物使用PCR扩增引物。在GenBank中（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）应用blastn对获得的基因片段进行同源性检索。

　　2结果

　　2.1真菌ITS2序列扩增及序列分析ITS2序列通用引物扩增的9种真菌，电泳显示在200bp～400bp范围内出现阳性条带，阴性对照鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、人类血细胞基因组均扩增阴性。分别挑选烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌的PCR扩增产物进行测序，测序结果均与表型鉴定的属种符合。

　　2.2临床分离丝状真菌ITS2序列扩增及序列分析ITS2序列通用引物扩增的7株临床分离丝状真菌，均出现阳性条带。阴性对照鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、人类血细胞基因组均扩增阴性。测序结果显示，血液来源的菌株鉴定为2例烟曲霉菌和1例马耳尼菲青霉菌，眼分泌物分离的菌株鉴定为2例镰孢菌，耳道脓液分离的菌株鉴定为2例黑曲霉菌。

　　3讨论

　　丝状真菌种类繁多，传统分类方法对人员要求较高，受培养条件影响，即使常见真菌也可能鉴定错误。真菌核糖体测序方法，能准确阐明临床真菌属种，方法简单、实用，技术要求较低，消除了不同实验者对表型实验结果的观察变异，易于在不同实验室之间建立标准的操作规程，可作为临床微生物实验室真菌常规鉴定工作的重要辅助手段。ITS2是真菌核糖体基因的内部转录间隔区2，常用于真菌的系统进化分析，是分子生物学方法鉴定真菌的理想靶序列[4]。

　　本研究利用真菌ITS2序列扩增及分析方法，准确鉴定出7株丝状真菌。烟曲霉菌为曲霉菌感染中最常见致病菌，烟曲霉菌感染的易感因素有粒细胞缺乏、尸体器官移植、重症监护室患者、外科手术及烧伤患者、肝衰竭、HIV感染、糖尿病患者[5]。马尔尼菲青霉菌是青霉菌中唯一的温度依赖型双相菌，是引起AIDS患者感染的主要致病菌[6]。镰孢菌在我国是引起的真菌性角膜炎的主要病原体[7]。本研究鉴定的2例黑曲霉菌，均分离于两位慢性中耳炎患者的耳道脓液，国内文献报道黑曲霉菌是真菌性耳炎的首要病原体[8]。

　　参考文献：

　　[1]朱红军，柯永坚，黄江玲.临床深部丝状真菌感染的病原菌分析[J].广东医学，2011，32（10）：1306-1308.

　　[2]郑冰，应春妹，汪雅萍.rDNA-ITS序列分析对临床少见丝状真菌鉴定作用的评估[J].检验医学，2011，26（10）：648-652.

　　[3]TurenneCY，SancheSE，HobanDJ，etal.RapididentificationoffungibyusingtheITS2Geneticregionandanautomatedfluorescentcapillaryelectrophoresissystem[J].JClinMicrobiol，1999，37（6）：1846-1851.

　　[4]燕勇，李卫平，高雯洁，等.rDNA-ITS序列分析在真菌鉴定中的应用[J].中国卫生检验杂志，2008，18（10）：1958-1961.

　　[5]陈云茹，陈天艳，赵英仁.烟曲霉菌感染的研究进展[J].临床内科杂志，2011，28（8）：514-517.

　　[6]周国强，肖钢，王敏.艾滋病合并马尔尼菲青霉菌病33例临床研究[J].中国感染控制杂志，11（6）：413-416.

　　[7]张军，王丽娅，孙声桃，等.镰孢菌属真菌性角膜炎的临床及共焦显微镜特征分析[J].眼科研究，2008，26（2）：219-214.

　　[8]杨琼，高春生，孙彩波，等.耳部真菌病临床分析（附187例报告）[J].中华耳科学杂志，2007，5（2）：161-163.

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