2株新城疫病毒的分离与鉴定(2)

人气指数:点发布时间:2014-03-13 15:12 来源：http://www.zgqkk.com 作者：陈广仁等

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　　3）其他诊断方法：主要包括免疫荧光抗体、酶联免疫吸附试验（ELISA）、单克隆抗体技术、核酸探针等分子生物学技术等。由于目前鸡群已普遍接种新城疫疫苗，血清学方法如未能区分抗体来自疫苗还是野外病毒之前，必须比较感染前后的抗体滴度是否有明显上升，才具有诊断意义。

　　4）与禽流感的鉴别诊断：H5亚型高致病性禽流感很少感染30日龄以内的雏鸡，其发病急、潜伏期和病程短，头肿、腿鳞出血，短时间内大批死亡，但无肠道枣核样坏死。发生H9亚型低致病性禽流感时，有头肿、拉稀和呼吸道症状，但病程较ND长，死亡也没有ND集中，也无神经症状和枣核样坏死，且死亡鸡通常有卵黄性腹膜炎和输卵管内分泌物。

　　3、综合防治

　　新城疫常以散发存在，对养殖业危害很大，必须严格按国家有关法令和规定，对疫情进行严格处理，必须认真地执行预防传染病的总体卫生防疫措施，以便减少爆发的危险，尤其是在每年的冬季，养鸡场均应采取严格的防范措施。

　　1）把好疫苗质量关：选择正规厂家生产的疫苗，严格遵守疫苗的运输、贮存规定，按照疫苗使用说明书进行操作。

　　2）排除母源抗体的干扰：有条件的用户（场）可监测其母源抗体水平，根据母源抗体水平的高低，利用“最佳首免日龄=（1日龄测得母源抗体滴度-4）×4.5+5，如果无法测得母源抗体时，可在1日龄用新城疫油乳剂灭火苗注射，同时IV系苗点眼或滴鼻，即可排除母源抗体的干扰，及早产生较强的免疫力。

　　3）合理制定和调整免疫程序：根据当地疫情，按先主后次的原则，合理制定免疫程序，尤其感染了法氏囊病后，应在鸡群恢复后对ND进行补免。

　　4）选择最佳的免疫途径：对个体免疫时，皮下注射或肌肉注射效果最好，点眼次之，滴鼻再次。对群体免疫而言，气雾免疫好于饮水免疫。

　　5）加强饲养管理，饲喂优质全价的饲料，使其内脏器官及免疫系统能正常发育。同时给鸡群创造安定、舒适的环境，使免疫鸡群处在健康状态。

　　6）切忌滥用药物：在免疫期间，禁止使用氯霉素、磺胺、呋喃、激素类药物，在免疫前后三天内更不可带鸡消毒，当然也并非任何药物都不能用，可适当用青霉素、喹诺酮等药物，以防继发感染。

　　7）如鸡群发病，要尽早隔离、并销毁病死鸡，同时对鸡群进行紧急接种。随着养殖规模的不断扩大，强毒污染时有发生，而疫苗接种只能减少病毒侵入鸡群时带来的损失，不能消灭鸡群内存在的强毒。因此，一定要加强饲养管理和卫生防疫措施，严格消毒，切断每个可能传播的途径，尽可能给鸡群一个清洁、舒适的环境，以利于其生长[8，9]。

　　4、材料与方法

　　4.1 试验材料

　　4.1.1 病料来源

　　病例一：2013年3月2日，盐都某养殖场鸡群发病，病死鸡日龄为300d，共养殖1000只，死亡200多只，剖检多呈现腹膜炎症状，喉、气管内有大量黏液，腺胃乳头出血，拉稀，脾脏肿大，卵子变性，2月龄通过饮水的方式用过副黏病毒疫苗，呼吸道、气管都有出血现象，无明显的神经症状，编号为YDND。

　　病例二：2013年5月20日，建湖某养殖场的2000只育成鸡，18周龄突然发病，每天死亡30-40只，且死亡有日渐增多的趋势。部分鸡精神沉郁，羽毛蓬乱，挤在一起或独处，缩于阴暗角落，极度衰弱，食欲减退或废绝，腹泻，排黄绿色粪便，剖检肌胃角质层下有点状或片状出血，腺胃乳头出血，部分肠管出血，编号JHND。

　　4.1.2 实验动物

　　10日龄非免疫鸡胚（购于山东家禽所SPF鸡场）。

　　4.1.3 制备1%鸡的红细胞

　　4.1.3.1 PBS的制备：氯化钠8g；磷酸氢二钠3.63g；蒸馏水100ml。

　　4.1.3.2 抗凝剂的制备：柠檬酸三钠5g，氯化钠0.9g，蒸馏水100 ml。

　　4.1.3.3 1%鸡红细胞的制备：采集三只健康公鸡的混合血，抗凝剂与鸡血比为1：4。加入PBS洗涤红细胞，每次洗涤在2000r/m离心15min，连续洗涤4～5次，最后红血球压积，1体积红血球加入99体积 PBS，混匀，4℃保存备用1～3天。

　　4.1.4 普通琼脂平板

　　将10g蛋白胨，3ml牛肉膏，5g氯化钠溶解于100ml蒸馏水中，加入15%氢氧化钠溶液约2ml调PH到7.2～7.4，加入琼脂2g，加热至使琼脂完全溶解，分装、高压灭菌（121℃，15min），浇平板，待用。

　　4.1.5 阳性血清

　　NDV阳性抗血清，H9亚型禽流感病毒的阳性抗血清，H5亚型禽流感病毒的阳性抗血清，（均由江苏省流行病学研究中心实验室提供）。

　　4.2 试验方法

　　4.2.1 细菌学检查

　　为区分是细菌病还是病毒病进行鉴别诊断：取肝、脾按常规触片染色镜检，同时接种普通琼脂平板，37℃培养48h后观察。

　　4.2.2 病毒分离

　　以无菌法取病死鸡的肝、脾、泄殖腔、气管等脏器。将病料按1：5加入双抗PBS（含庆大霉素与链霉素）于高压过的研钵中研磨，收集研磨液，反复冻融三次。以7000r/m，离心10min，再次用双抗PBS1：2稀释，离心同上。置4℃冰箱，备用。

　　4.2.3 鸡胚接种

　　1.用照蛋器照蛋，弃去死胚、未受精胚及不健康的鸡胚。画出气室边缘和无毛细血管处。

　　2.气室端先用碘酊消毒，然后用75%的酒精脱碘，再用消毒过的镊子在各鸡胚上打一小孔。

　　3.用消毒的注射器吸取处理好的病毒样品，按每只0.1～0.2ml，接种于鸡胚的尿囊腔，用石蜡熔融封口。

　　4.置35～37℃恒温箱培养，24h死亡鸡胚弃去，收集24～96h内死亡鸡胚的尿囊液。

　　5.收胚前将鸡胚转移至4℃冷藏6h。用75%的酒精消毒鸡胚气室部分，用无菌镊子将消毒过的蛋壳打碎，再用另一把无菌镊子将壳膜和尿囊膜撕开，并将鸡胚轻轻推向一侧，压住，用吸管收取尿囊液。

　　4.2.4 血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI）

　　4.2.4.1 HA试验

　　按常规微量法进行，结果以出现100%凝集的病毒的最大稀释度为该样品的HA效价。试验操作方法：将25?l PBS或生理盐水加入96孔V型微量反应板A～H行的1～12孔。被检病毒病料各25?l分别加入A～H行的第一孔，然后倍比稀释至第11孔，弃去25?l，12孔为阴性对照。没空再加入25?l PBS或生理盐水，最后悬空加入25?l的1%鸡红细胞于每一孔。混匀，室温静置，观察试验结果，确定HA滴度。

　　4.2.4.2 HI试验

　　按常规微量法进行，结果按完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度为血凝抑制价。试验操作方法：将25?l PBS或生理盐水加入96孔V型微量反应板A～H行的1～12孔；在第一行、第二行和第三行的第一孔依次加入NDV、H5亚型禽流感、H9亚型禽流感病毒标准阳性抗血清；用移液器对血清进行倍比稀释至第10孔，然后每排弃去25?l；在每排1～11孔加入25?l 4单位病毒，置振荡器上混匀，放入37℃恒温箱中作用10min；在每排各孔加入1%鸡红细胞50?l，第12孔补加50?l PBS保证总体积一致，振荡混匀后，室温或置37℃恒温箱中作用15～30min，观察试验结果。

　　4.2.5 鸡胚平均死亡时间（MDT）的测定

　　用灭菌生理盐水连续10倍稀释病毒（10-1….10-9），每一稀释度接种5枚非免疫鸡胚，每胚0.2ml，同时设置5枚接种生理盐水的鸡作为对照组。37℃恒温孵育，弃取24小时内死亡的鸡胚，之后每隔6小时观察一次，直至120小时。能够使所有鸡胚致死的病毒的最大稀释倍数即为病毒的最小致死量（MLD），MDT是MLD致死鸡胚的平均死亡时间。经试验得知这两样品的最小致死量均为10-7稀释度，取该稀释度接种5个10日龄的非免疫鸡胚，每个尿囊腔接种0.2ml。同时设置5枚接种生理盐水的鸡作为对照组，接种后的鸡胚在37℃孵育7天，每天早晚各照胚一次，记录每组鸡胚中各个胚死亡的时间。

　　5、结果

　　5.1 细菌学检查

　　37℃培养48h后，观察平板，琼脂平板上无任何细菌生长，表明该样品的病原不是细菌。

　　5.2 病毒分离

　　将处理的病料接种10日龄非免疫鸡胚后，于24h～96h内死亡，鸡胚呈全身出血性病变，尤其是头部和四肢出血严重。取死亡的鸡胚置4℃过夜（不超过24h）后无菌采集尿囊液，尿囊液清亮。

　　5.3 HA和HI试验结果

　　通过HA试验，可知两样品的血凝价分别为7log2、6log2（见表1）；通过血凝抑制试验可知：这两病毒样品都既不能被H5亚型禽流感抗血清抑制，也不能被H9亚型禽流感抗血清抑制，只能被NDV阳性抗血清抑制，其HI效价分别为1：4log2、1：3log2（见表2），结果显示从两地病鸡中分离出的病原都为新城疫病毒。

　　表1 HA试验结果

　　样品号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

　　YDND # # # # # # # — — — — —

　　JHND # # # # # # +++ ++ + — — —

　　注：#为完全凝集；++为不完全凝集；—为不凝集

　　表2 HI试验结果

　　样品阳性血清 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

　　YDND NDV抗血清 — — — — # # # # # # # —

　　YDND H5亚型禽流感抗血清 # # # # # # # # # # # —

　　YDND H9亚型禽流感抗血清 # # # # # # # # # # # —

　　JHND NDV抗血清 — — — # # # # # # # # —

　　JHND H5亚型禽流感抗血清 # # # # # # # # # # # —