作者：汤南，张丹，孙文霞
【摘 要】目的建立检测注射用丹参酮ⅡA磺酸钠中内毒素的试验方法。方法运用干扰初筛法对供试品进行干扰试验，采用鲎试剂法对样品中的内毒素进行检测。 结果注射用丹参酮ⅡA磺酸钠在药液稀释浓度为0.016 8 mg·ml-1以下时，与鲎试剂反应无干扰。结论所采用的细菌内毒素检查法可用于注射用丹参酮ⅡA磺酸钠的内毒素检查。
【关键词】注射用丹参酮ⅡA磺酸钠 细菌内毒素检查法 干扰试验
Abstract：ObjectiveTo establish a method for detection of bacterial endotoxin in sodium tanshinone IIA sulfonate injection.MethodsAfter interfering experiment, tachypleus amebocyte lysate(TAL) was performed to detect the bacterial endotoxin in sodium tanshinone IIA sulfonate injection. ResultsSodium tanshinone IIA sulfonate injection did not interfere with limulus agent when the injection was diluted to the concentration lower than 0.016 8 mg·ml-1. ConclusionThe bacterial endotoxin test is suitable for the detection of bacterial endotoxin in sodium tanshinone IIA sulfonate injection.
Key words：Sodium tanshinone IIA sulfonate injection; Bacterial endotoxin test; Interference experiment
细菌内毒素检查法又称鲎试剂法，是利用鲎试剂与细菌内毒素发生凝集反应，来检查药品中内毒素含量是否符合规定的方法，具有快速、灵敏，重复性好，操作简便的特点。
丹参酮ⅡA磺酸钠为丹参酮ⅡA经磺化而成的水溶性钠盐，它能增加冠脉血流量，提高心肌耐缺氧能力，抑制血小板集聚及抗血栓形成［1］，临床上主要用于冠心病、心绞痛等症的治疗。本检查法采用两个厂家的鲎试剂对3批注射用丹参酮ⅡA磺酸钠进行了细菌内毒素检查的干扰试验。现报道如下。
1 材料
注射用丹参酮ⅡA磺酸钠（四川大学华西药学院药剂学教研室，批号：040101、040102、040103，规格：10mg）；鲎试剂（TAL：标示灵敏度0. 125 EU·ml-1，批号：0305301，标示灵敏度0.06 EU·ml-1，批号0302011，湛江安度斯生物有限公司；标示灵敏度0.06 EU·ml-1，批号20030321，湛江海洋生物制品厂）；细菌内毒素工作标准品（10 EU·支-1，批号：030723，中国药品生物制品检定所）；细菌内毒素检查用水（BET水：含细菌内毒素<0.003 EU·ml-1，批号：0308050，湛江安度斯生物有限公司）。
XW-80旋涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；KXB-12A恒温培养箱（上海科析试验仪器厂）。其余实验材料均经250℃烘烤1 h。
2 方法与结果
2.1 鲎试剂标示灵敏度（λ）的复核以细菌内毒素检查用水溶解内毒素工作标准品，并配制成含内毒素2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ系列浓度的溶液。每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照，记录结果，并按式λC = antilg（∑X/4）计算λC值。结果表明：每一批鲎试剂灵敏度测得值均在0.5～2.0λ范围内，符合要求，可按标示灵敏度值使用。结果见表1。表1 鲎试剂灵敏度复核结果（略）
2.2 内毒素限值（L）的确定本品临床用法用量为40～80 mg·60 kg-1，故
L=5.0 EU·Kg-1·h-11.33 mg·kg-1·h-1=3.76 EU·mg-1
综合考虑本品临床用药的相关因素，将本品细菌内毒素限值确定为3.75 EU·mg-1。
2.3 干扰试验预试验根据最小有效稀释浓度，c=λ/L，可知对应于灵敏度(λ)0.25，0.125，0.06，0.03 EU·ml-1TAL，注射用丹参酮ⅡA磺酸钠稀释浓度分别为0.067，0.033 5，0.016 8，0.008 38 mg·ml-1，用BET水将供试品(批号：040101)稀释成以上4个浓度备用。
取16支λ为0.125 EU·ml-1的TAL，其中8支作为供试品阴性对照NPC，即分别用0.1 m1上述稀释的4个浓度供试品复溶TAL，再各加0.1 mlBET水，每一浓度供试品 2 支反应管；另8支作为供试品阳性对照PPC，即分别用0.1 ml上述稀释的4个浓度供试品复溶TAL，再各加2λ(0.25 EU·ml-1)的内毒素溶液0.1 ml，每一浓度供试品 2 支反应管。结果见表2。本品稀释至0.016 8 mg·ml-1以下时，可能对细菌内毒素与鲎试剂的反应无干扰作用。故拟采用λ为0.06 EU·ml-1的TAL，本品0.016 8 mg·ml-1稀释浓度作正式的干扰试验。表2 样品干扰试验预试验结果（略）
2.4 供试品干扰试验用BET水和0.0168 mg·ml-1的供试品液分别复溶TAL(λ为0.06 EU·ml-1)，然后将每一供试品液复溶的TAL分别分为4列，每列4支；对应各列分别加入含细菌内毒素2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ 4种浓度的溶液。另取BET水和3批供试液各2支作为阴性对照管。于37～38℃恒温60 min，观察结果，并按Es=antilg（∑X/4），Et=antilg（∑X/4）计算Es和 Et。结果Es、Et在0.5～2.0λ之间，且Et /Es的值在0.5～2.0之间，可以认为0.016 8 mg·ml-1的供试品浓度对细菌内毒素与鲎试剂的反应无干扰作用（见表3）。表3 供试品干扰试验结果（略）
2.5 供试品细菌内毒素检查取3批供试品用细菌内毒素检查用水稀释为0.016 8 mg·ml-1，以灵敏度为0.06 EU·ml-1 的鲎试剂依法检查。结果见表4。结果3批样品均符合规定。表4 供试品细菌内毒素检查结果（略）
3 讨论
由干扰预试验可知，NPC系列反应全部为阴性，PPC系列反应在供试品稀释浓度>0.033 5 mg·ml-1时为阴性，≤0.016 8 mg·ml-1时为阳性。说明供试品在较高浓度时对鲎试剂与细菌内毒素的反应有抑制作用，而将供试品稀释至0.016 8 mg·ml-1（最大不干扰浓度），并选用其对应灵敏度的TAL后则无干扰作用。
本实验结果证实，将本品适当稀释后对细菌内毒素与鲎试剂的反应无干扰作用，说明采用细菌内毒素检查法进行本品热原质的安全性检查具有可行性，可建立该品种的细菌内毒素检查法。
【参考文献】
［1］华浩明，王灿晖. 不稳定型心绞痛的研究进展及中医药防治概况［J］.中国中西医结合急救杂志，2003，10(2)：123.
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