2.3MTT法筛选柚皮苷抑制破骨细胞最佳浓度采用MMT法测定不同浓度柚皮苷（500，100，50，20，10，1μg·L-1）对破骨细胞的抑制作用。破骨细胞在加入含柚皮苷的培养基中培养48h后，用MTT试验检测柚皮苷对破骨细胞的抑制作用，利用酶标仪，在570nm波长处测定吸光度A。结果显示柚皮苷在20μg·L-1抑制作用最强，见图1。根据以上的筛选结果采用20μg·L-1的柚皮苷进行以下实验研究。
　　与对照组相比1）P<0.05，2）P<0.01（图5同）。
　　2.4TRAP阳性细胞计数与骨吸收面积分析实验分为对照组和柚皮苷组（20μg·L-1），按照上述诱导方法，柚皮苷组采用含有20μg·L-1柚皮苷的诱导剂进行诱导，5d后取出玻片，进行TRAP染色（方法同上）。计数标准：2组分别在100倍视野下随机选取10个视野进行计数，取平均值;细胞呈现玫瑰红色或粉红色，细胞核≥3个，上述实验重复3次。骨吸收陷窝操作方法同上，2组各10张薄骨片，每张骨片随机选取10个区域，区域之间无重叠，采用ImageProPlus6.0图像分析软件对骨吸收面积进行分析。
　　2.5流式细胞术检测细胞增殖对照组与柚皮苷组诱导培养第5天后，胰酶消化法收集细胞，PBS离心清洗2次，弃上清，加入预冷（4℃）的70%乙醇1mL，吹打均匀，4℃固定8h，PBS清洗2次。以1mL含有0.2mgRNaseA的碘化丙啶/TritonX-100染色液重悬细胞，37℃染色15min。流式细胞仪检测细胞中DNA含量和细胞周期，计算S期细胞百分率与细胞增殖指数（PI）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。
　　2.6荧光定量PCR检测相关基因表达细胞诱导培养5d后，收集细胞，加1mLTRIzol溶液，振荡混匀。采用相分离技术抽提取RNA，琼脂糖电泳法检测：RANK，TRAP，MMP-9，NFATc1与C-fos基因浓度及完整性。各组检测基因反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，引物由广州复能基因有限公司设计。基因引物序列：GAPDH正向引物5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，反向引物5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′，扩增片段为96bp;NFATc1正向引物5′-TCCAAAGTCATTTTCGTGGA-3′，反向引物5′-CTTTGCTTCCATCTCCCAGA-3′;c-Fos正向引物5′-CAGCCTTTCCTACTACCATTCC-3′，反向引物5′-ACAGATCTGCGCAAAAGTCC-3′;MMP-9正向引物5′-ACGACATAGACGGCATCCA-3′，反向引物5′-GCTGTGGTTCAGTTGTGGTG-3′;TRAP正向引物5′-AAATCACTCTTTAAGACCAG-3′，反向引物5′-TTATTGAATAGCAGTGACAG-3′;RANK正向引物5′-CCAGGGGACAACGGAATCA-3′，反向引物5′-GGCCGGTCCGTGTACTCATC-3′。逆转录反应体系、PCR扩增体系以及反应条件按照试剂盒说明书设定。反应完成后进行扩增曲线和熔解曲线分析。基因表达量以检测基因的初始模板量以2-ΔΔCt表示。
　　2.7统计学分析所得数据采用SPSS16.0进行分析，计量资料采用±s表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　3结果
　　3.1破骨细胞鉴定RANKL诱导RAW264.7细胞株3d后开始有TRAP染色阳性的破骨细胞，诱导第5天后破骨细胞数量明显增多。TRAP阳性细胞呈玫瑰红色/红酒样，细胞核呈阴性，有多个细胞核;薄骨片可见骨纤维的连续性中断，出现骨陷窝，陷窝中可见残留的骨胶原纤维，见图2。
　　3.2TRAP阳性细胞计数与骨吸收面积分析
　　RANKL诱导5d后，进行TRAP染色。对照组破骨细胞数量比较多，且细胞核较多，TRAP（+）细胞数为（29.4±3.2）个;柚皮苷组破骨细胞数量少，细胞核较少，TRAP（+）细胞数为（19.6±2.4）个（P<0.05），见图3。对照组骨吸收陷窝数目较多，骨吸收总面积较大，为（3451.6±108.2）μm2;而柚皮苷组骨吸收数目少，总面积小，为（1972.4±96.4）μm2（P<0.05），见图4。
　　3.3对破骨细胞增殖的影响柚皮苷组细胞增殖指数（PI）为（21.74±2.57），低于对照组的（16.12±1.24），P<0.05。
　　3.4对破骨细胞分化过程相关基因的表达情况与对照组比较，柚皮苷可以明显的抑制TRAP特异性基因的表达（P<0.05）;对RANK基因表达无影响;对NFATc1基因有显著抑制作用（P<0.01）;而对C-fos基因有明显的促进作用（P<0.05）;对MMP-9特异性基因有一定的抑制作用（P<0.05），见图5。
　　4讨论
　　破骨细胞是来源于骨髓造血干细胞或骨髓远祖干细胞的终末分化的多核巨细胞，直接参与了骨重建的过程。在骨组织内，破骨细胞引起骨的破坏和吸收，是调节骨重建过程的重要细胞[4]。骨质疏松患者的破骨细胞常常处于活跃状态，骨吸收活性大于骨形成，导致骨量的丢失，骨结构的破坏。因此，抑制活跃的破骨细胞是防治骨质疏松的重要途径之一。
　　本实验根据中医学“肾主骨生髓”的基本理论与中药骨碎补的记载等理论，选取骨碎补单体成分柚皮苷。国内外均有报道骨碎补单体柚皮苷有明显促进成骨细胞分化、增殖的作用[3，5-7]。本课题组前期试验证实柚皮苷可以明显促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用，促进骨钙蛋白（OCN）、成骨特异性转录因子（Runx2）及I型胶原（ColI）基因表达[7]。
　　在动物水平，WeiM等[8]认为柚皮苷可明显提升视黄酸诱导的大鼠骨质疏松模型骨密度;PangWY等[9]认为柚皮苷可能是通过激活成骨细胞上配体依赖型的雌激素受体来发挥抗去势大鼠骨质疏松作用;LiN等[3]认为柚皮苷可能通过促进成骨细胞的分化、促进成骨细胞骨钙蛋白的表达，而有效的逆转去势造成的骨质疏松。
　　本课题组首次研究了柚皮苷对破骨细胞分化的作用，对TRAP阳性细胞计数发现柚皮苷（20μg·L-1）可以抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成与破骨细胞的骨吸收功能。同时流式细胞术检测证实柚皮苷可以抑制破骨细胞的增殖。提示柚皮苷不仅可以促进成骨细胞的分化、增殖。还能抑制破骨细胞的形成、增殖以及骨吸收功能。
　　TRAP酶为破骨细胞骨吸收相关的标志性酶之一[10]，柚皮苷对TRAP有明显的抑制作用，从而抑制破骨细胞骨吸收功能;RANK位于破骨细胞/前体细胞膜表面，是RANKL的受体，C-MSF可增加破骨细胞前体细胞表面的RANK受体含量，RANKL与RANK结合引发一系列的生化反应，从而促进单核细胞聚集为多核的成熟的破骨细胞[11]，本研究观察发现柚皮苷对RANKmRNA表达无影响。
　　NFATc1，C-fos是破骨细胞分化过程中重要的转录因子，可调控破骨细胞多种特异性基因表达，控制破骨细胞的形成及其功能[12-13];在RANKL诱导下，经过一系列因子反应细胞质内的NF-κB被激活，进入细胞核，与细胞核内的NFATc2共同作用于NFATc1的启动子，诱发NFATc1基因开始表达;随后在C-fos作用下NFATc1基因进入扩增阶段;RANKL刺激还可通过JNK通路使C-fos与C-Jun结合，募集到NFATc1基因的启动子上，促进NFATc1基因扩增，NFATc1为破骨细胞分化过程起始的重要基因[14-16]。笔者研究发现柚皮苷可以促进C-fos基因的表达，而最终的结果是导致NFATc1基因表达降低，可能与柚皮苷通过别的通路升高C-fos基因有关，抑制破骨细胞分化过程的启动基因NFATc1，进而影响破骨细胞的分化及其吸收功能。
　　MMP-9作为降解细胞外基质的重要酶类，可以降解骨Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型胶原，MMP-9不仅与破骨细胞的骨吸收作用有关，同时与破骨细胞移行有关。MMP-9基因缺失，会阻碍破骨细胞的移动[17]。研究证实柚皮苷有显著降低MMP-9的作用，从而抑制破骨细胞对骨胶原降解的作用。
　　综上所述，柚皮苷抗骨质疏松作用，除了通过促进成骨细胞的分化、增殖发挥作用外，尚能抑制破骨细胞的分化与骨吸收功能。

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