3饲养层细胞的发展与无饲养层细胞培养条件
　　3.1饲养层细胞
　　传统的方法使用MEF作为饲养层细胞来维持胚胎干细胞的生长，但是由于潜在污染的问题，MEF并不是最理想的滋养层细胞。有研究者指出，MEF能够为胚胎干细胞提供更多的增殖空间，而HFF（human foreskin fibroblast，HFF）分泌的生长因子能够更好的促进胚胎干细胞的生长，鉴于这个特点，以期能更好的支持胚胎干细胞的生长，人们使用小鼠成纤维细胞跟人包皮成纤维细胞按比例混合而成的混合饲养层细胞来培养hESC，相对利用单一的饲养层细胞相比较来说，生长在单一的饲养层细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、较薄，而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实，其克隆形态显著好于单一饲养层，但是这种方法并没有避免异源性物质的污染问题。为了找寻非动物源性的饲养层细胞，人们采用了处于不同发育阶段的不同组织来源的人体细胞作为MEF的替代品，如：人类包皮成纤维细胞、胎盘细胞、子宫内膜细胞、成人骨髓基质细胞、胎儿肌肉细胞、胎儿皮肤细胞。尽管不同的细胞取得的效果不同，但都能使干细胞保持未分化的状态。此外，胚胎干细胞自身分化所形成的成纤维细胞样细胞也能成为一个自体的饲养层细胞来源。由此得到的饲养层细胞，具有特异性，避免了动物源性成分或异源性成分对于胚胎干细胞的污染。
　　3.2无饲养层细胞培养条件
　　为了进一步纯化胚胎干细胞以减少日后使用的风险，有学者提出是否能够采用成分明确的物质的组合来彻底替代饲养层细胞的粘附功能及分泌功能，为了解决这个问题，van Hoof等利用基底膜基质（Matrigel）和纤连蛋白（fibronectin）来代替饲养层细胞的功能，同时，利用饲养层细胞条件培养基（feeder conditioned media）跟成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor）维持干细胞的未分化状态，这种方法取得了不错的效果。事实上，这种无饲养层细胞的培养条件能够很好地维持胚胎干细胞的生长及未分化状态，许多实验室现在都采用这种条件培养胚胎于细胞。
　　3.3胚胎干细胞的体外培养液体系
　　为了避免培养液中所含成分对胚胎干细胞的潜在污染，人们从不同方而做出了努力。首先，在饲养层细胞的培养基方面，人们用成分确定的培养基、细胞因子以及人血清培养人成纤维细胞，得到了不含任何动物源性以及不确定成分的饲养层细胞株。这种方法既保留了饲养层细胞在胚胎干细胞培养过程中的作用，又避免了动物源性成分对胚胎干细胞的污染。胚胎干细胞的培养基方面，传统的培养基中含有FBS （fetal bovineserum），其中包含有动物源性的蛋白以及一些成分不确定的物质，使得所建的干细胞株可能被污染。为了解决这一问题，Richards等用人血清替代FBS进行胚胎干细胞的维持，以期能够避免动物源性成分对胚胎干细胞的潜在污染。但是，由于人血清中也含有许多复杂的、成分不明确的物质，而且有可能包含有一些诱导胚胎干细胞分化的物质，所以也没有很好地解决问题。后来的学者利用成分更加确定的血清替代品（knockout serumreplacement，KSR）来代替FBS。有趣的是，与含有FBS的培养基相比，在KSR培养基中胚胎干细胞表现出更强的增殖能力，但是，血清替代品仍然包含有动物蛋白，而且并不是成分完全确定的，所以也不是最理想的。此外专为培养胚胎干细胞而设计的培养基mTESRl能很好的维持人胚胎干细胞的生长，但是，这种培养基仍然包含有少部分动物源性成分。成分确定的培养基是至关重要的。学者们希望通过采用一些已知成分的组合来代替传统的培养基，这样既维持了胚胎干细胞的生长，也不会造成潜在的污染。一些研究组织报道了在培养基中成功使用各种不同组分能够成功地维持胚胎干细胞未分化状态的例子，如：bFGF和透明质酸（hyaluronic acid），转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、bFGF和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF），bFGF和GSK3抑制剂（GSK3 inhibitor），激活素A （activin A）和bFGF等。Wang、Xu等发现，利用BMP信号转导通路拮抗剂（BMP sig—naling antagonist Noggin）和高浓度的bFGF就可以维持胚胎干细胞处于未分化状态。Beattie等发现，在培养基中使用激活素A、烟酰胺（nicoti-namide，NIC）和角化细胞生长因子（keratinoCytegrowth factor，KGF）能够维持细胞的末分化状态，并认为激活素A能够阻断干细胞的分化，烟酰胺和角化细胞生长因子则在细胞增殖方面起作用。通过这些方法，将成分明确的物质组合起来，就使得培养基的组成更为简单，成分更为确定。近来，建立起第一株人类干细胞的Thomson实验室的学者们，为了使得培养出来的hESCs和iPS能够更接近于临床使用的目标，利用8种成分已经确定的成分组成胚胎干细胞的培养基（E8），在实际的应用过程中，这些成分确定而又简单的培养基在维持胚胎干细胞及诱导多能干细胞的未分化状态以及细胞增殖方面也取得了不错的效果。
　　4临床级别的人胚胎干细胞
　　人们期望利用胚胎干细胞的特性来治疗各种退行性疾病，这就要求我们所建立的人胚胎干细胞株必须是临床级别的细胞。如何获得临床级别的人胚胎干细胞是一个难题，目前人们大多使用GMP（good manufacturing practices，GMP）的标准来确保所获得的人胚胎干细胞的质量以及判断其是否为临床级别的细胞。GMP要求从人胚胎干细胞建株过程中的各个环节都有质量保证。首先，实验过程中所使用的耗材及试剂必须经过GMP认证，实验平台需通过GLP（good laboratorypractice，GLP）质量认证，实验中所使用的饲养层细胞必须是在符合GLP的实验平台上采用符合GMP标准的试剂与耗材建立起来的细胞株，饲养层细胞必须符合GMP标准或获得FDA（food anddrug administration，FDA）认证。同时，胚胎干细胞的操作必须有标准的操作程序，实验人员的培训必须符合GMP的标准，所获得的人胚胎干细胞需经过QC（quality certification，QC）的检测及生物安全性检测。现有的胚胎干细胞体外培养液体系，由于其未避免异源性基因的插入，或由于其体系中含有成分不确定的组分而可能对胚胎干细胞造成潜在污染的风险，都不能完全符合临床使用的要求。只有符合GMP标准的临床级细胞，使用到临床时，才能确保细胞的安全性。寻找更加优化、成分更加确定的、不含有动物源性成分的培养条件显得尤为重要。虽然现存的各种培养液体系经过全球科学家多年的不断悉心探索，已经取得了长足的进步，但是由于培养液体系中的种种缺陷，使得在这些条件下建立起来的人胚胎干细胞仍然不能完全符合临床使用的要求，在寻求最优化的培养液体系的道路上，我们仍然任重道远。
　　5结论与展望
　　在过去的十几年中，胚胎干细胞事业以迅猛的势头不断地向前发展，迅速成为当今最热门的研究内容。由于其独有的特性，胚胎干细胞以后的应用也具有广阔的前景。尽管从第一株胚胎干细胞建立成功以来，胚胎干细胞培养体系的各个方面都不断地得到升级跟优化，但是，由于后期应用于临床移植治疗的需求，目前所建立起来的胚胎干细胞系因为各种原因仍然不适合在临床应用。除此之外，目前各种培养体系也并不是最优化的。如何提高胚胎干细胞的建株成功率、如何改变培养基的成分使其真正成为最优化、如何使得建立起来的胚胎干细胞株符合GMP标准而最终能适合于临床应用、目前建立起来的胚胎干细胞是否真正具有全能性等一系列问题仍然有待解决，只有在真正解决了这些问题之后，胚胎干细胞才能真正发挥其最大的潜力而最终造福于人类。

---

期刊库（http://www.zgqkk.com），是一个专门从事期刊推广、投稿辅导的网站。
　　本站提供如何投稿辅导，寻求投稿辅导合作，快速投稿辅导，投稿辅导格式指导等解决方案：省级投稿辅导/国家级投稿辅导/核心期刊投稿辅导//职称投稿辅导。

---

　　【免责声明】本文仅代表作者本人观点，与投稿辅导_期刊发表_中国期刊库专业期刊网站无关。投稿辅导_期刊发表_中国期刊库专业期刊网站站对文中陈述、观点判断保持中立，不对所包含内容的准确性、可靠性或完整性提供任何明示或暗示的保证。请读者仅作参考，并请自行承担全部责任。