作者：周娟娟,潘金火,卢欢,朱和平,潘文
【摘要】目的 建立清燥润肺合剂的质量标准。方法 采用薄层色谱法对制剂中桑叶、甘草、北沙参、麦冬、枇杷叶进行定性鉴别；采用高效液相色谱法对制剂中甘草酸含量进行测定。结果 薄层色谱中阴性无干扰,专属性强；甘草酸在0.203 1～1.692 1 μg范围内线性关系良好,r＝0.999 8,平均回收率为98.24%,RSD＝2.62%。结论 本试验建立的方法简便、快捷,重复性好,可用于清燥润肺合剂的质量控制。
【关键词】清燥润肺合剂；质量标准；甘草酸；高效液相色谱法；薄层色谱法
Key words：Qingzao Runfei Mixture；quality standard；glycyrrhizic acid；HPLC；TLC
清燥润肺合剂由桑叶、石膏、甘草、黑芝麻、北沙参、麦冬、枇杷叶等9味药材组成。具有清燥润肺之效,用于燥气伤肺、干咳无痰、气逆而喘、咽干鼻燥、心烦口渴等病症。笔者根据处方组成药物的理化性质[1]及反复试验,对桑叶、甘草、北沙参、麦冬、枇杷叶进行了鉴别,同时,采用高效液相色谱法测定了制剂中甘草酸的含量,建立了可靠、稳定、简单的质量控制方法。
1 仪器与试药
Agilent1100高效液相色谱仪,Agilent1100紫外检测器,HP Chemstations工作站。清燥润肺合剂10批样品由扬州市三药制药有限公司生产并提供(批号为061101、061102、061103、061104、061105、061106、061107、061126、061128、061130)；甘草药材购自扬州市药材公司(由扬州市三药制药有限公司提供,批号为060912、060920、060928),经南京中医药大学王春根教授鉴定为豆科植物甘草的干燥根及根茎；甘草酸铵对照品购自中国药品生物制品检定所(批号110731- 200511)。硅胶G由青岛海洋化工厂生产；所有试剂由上海久亿化学试剂有限公司生产,均为分析纯或色谱纯。
2 定性鉴别
2.1 桑叶
取桑叶对照药材2 g,加石油醚(60～90 ℃)20 mL,超声处理20 min,弃去石油醚液,药渣挥干,加无水乙醇30 mL,超声处理20 min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30 mL使溶解,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为对照药材溶液。取本品20 mL,蒸干,残渣加80%乙醇50 mL,超声处理20 min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30 mL使溶解,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。取除桑叶以外的其它8味药材按处方比例制得的阴性样品20 mL,用与供试品溶液制备相同的方法制得阴性对照液。
吸取上述3种溶液各5 μL,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶1)的上层溶液为展开剂,置于展开剂预饱和20 min的展开缸内,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱对应的位置上,显示相同颜色的荧光斑点,而阴性对照液无此斑点。
2.2 甘草[2]
取甘草对照药材1 g,加乙醚30 mL,超声处理20 min,滤过,药渣挥干,加甲醇30 mL,超声处理20 min,滤过,滤液挥干,残渣加水30 mL使溶解,滤过,用水饱和的正丁醇萃取2次,每次20 mL,合并正丁醇液,用水洗涤2次,每次20 mL,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为对照药材溶液。取本品10 mL,加乙醚30 mL,超声处理20 min,静置分层,置分液漏斗中,分出水层,用水饱和的正丁醇提取2次,每次20 mL,合并正丁醇液,用水洗涤2次,每次20 mL,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。取除甘草以外的其它8味药材按处方比例制得的阴性样品10 mL,按供试品溶液制备方法制得阴性对照液。
吸取上述3种溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%的硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照液无干扰。
2.3 北沙参
取北沙参对照药材5 g,加乙醚30 mL,加热回流1 h,滤过,滤液挥干,残渣加乙醇1 mL使溶解,作为对照药材溶液。取本品10 mL,蒸干,残渣加乙醇20 mL使溶解,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。取除北沙参以外的其它8味药材按处方比例制得的阴性样品10 mL,按供试品溶液制备方法制得阴性对照液。
吸取上述3种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(1∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置氨缸内熏40 min,紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱对应的位置上,显示相同颜色的荧光斑点,阴性对照液无干扰。
2.4 麦冬
取麦冬对照药材2 g,加水20 mL,加盐酸2 mL,煮沸2 min,放冷,滤过,滤液用三氯甲烷10 mL萃取,取三氯甲烷液,蒸干,残渣加三氯甲烷0.5 mL溶解,作为对照药材溶液。取本品10 mL,加盐酸1 mL,煮沸2 min,放冷,滤过,滤液用三氯甲烷10 mL萃取1次,取三氯甲烷液,蒸干,残渣加三氯甲烷0.5 mL使溶解,作为供试品溶液。取除麦冬以外的其它8味药材按处方比例制得的阴性样品10 mL,按供试品溶液制备方法制得阴性对照液。
吸取上述溶液各约5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇(20∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%的硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照液无干扰。
2.5 枇杷叶
取枇杷叶对照药材5 g, 加水200 mL煎煮2 h,滤过,滤液用5%的氢氧化钠溶液调pH值至10,用乙酸乙酯40 mL萃取,浓缩,残渣加1 mL甲醇溶解,作为对照药材溶液。取本品10 mL,加水20 mL稀释,摇匀,滤过,用5%的氢氧化钠溶液调pH值至10,用乙酸乙酯40 mL萃取,浓缩,残渣加1 mL甲醇溶解,作为供试品溶液[3]。取除枇杷叶以外的其它8味药材按处方比例制得的阴性样品10 mL,按供试品溶液制备方法制得阴性对照液。
吸取上述溶液各约10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(8∶4∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%的硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照液无干扰。
3 含量测定
3.1 色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸(63∶36.6∶0.4)为流动相；检测波长为250 nm；柱温30 ℃。理论塔板数按甘草酸峰计算应不低于3 000。
3.2 对照品溶液的制备
精密称取甘草酸铵对照品,加甲醇制成0.207 3 mg/mL的溶液。精密量取5 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得0.103 65 mg/mL的对照品溶液。
3.3 供试品溶液的制备
取10个批号的样品,每批取2份,分别精密量取20 mL,加水饱和的正丁醇20 mL,超声30 min,置分液漏斗中取正丁醇液。下层加水饱和的正丁醇20 mL萃取,合并正丁醇液,蒸干,残渣用甲醇定量转移至10 mL量瓶中,定容,摇匀,即得。
3.4 空白试验
取除甘草以外的其它8味药材,按处方比例制得阴性样品,按供试品溶液的制备方法制得阴性对照液。精密吸取10 μL,连续进样3次。结果表明,空白对照液未检出与甘草酸铵对照液对应的色谱峰,视为空白无干扰。色谱图见图1。
3.5 线性关系考察
分别吸取浓度为0.103 65 mg/mL的甘草酸铵对照品溶液(折合甘草酸为0.101 53 mg/mL)2、4、6、8、10 mL,用甲醇定容至10 mL,各进样10 μL。以甘草酸铵平均峰面积为纵坐标,进样量(μg)为横坐标进行线性回归,得回归方程：Y＝721.62X－16, r＝0.999 8,指标成分甘草酸的线性范围为0.203 1～1.692 1 μg。
3.6 精密度试验
精密吸取同一对照品溶液10 μL,连续进样5次,结果测得甘草酸铵峰面积值的RSD＝0.71%。
3.7 稳定性试验
精密吸取批号为061105的样品溶液10 μL,每间隔2 h进样1次,连续考察10 h,峰面积的RSD＝0.74%,表明指标成分在10 h内比较稳定。
3.8 重复性试验
取同一批号(061105)的样品5份,按“样品测定”项下方法测得样品中甘草酸铵的含量,RSD＝2.11%,表明重复性良好。
3.9 加样回收率试验
取已知含量同一批号(061105)的样品6份,精密量取10 mL,分别精密加入浓度为0.103 65 mg/mL的甘草酸铵对照液4 mL,按供试品溶液的制备方法制得供试液。照“样品测定”项下方法测定,计算样品中甘草酸铵含量及加样回收率,结果见表1。表1 加样回收率试验结果（略）
3.10 样品测定
取10个批号的样品适量,按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液。按上述色谱条件,分别进样10 μL,各进2针,用标准曲线法计算含量。10个批号样品甘草酸含量测定结果依次为0.031 8、0.038 3、0.039 3、0.037 1、0.038 9、0.038 6、0.038 5、0.038 9、0.039 1、0.039 1 mg/mL。
4 讨论
在定性鉴别的选取上,因为苦杏仁中的主要成分是苦杏仁苷,且其他成分的含量很少,而枇杷叶中也同样含有苦杏仁苷,故未对苦杏仁进行试验；而阿胶、黑芝麻的鉴别,经过试验,阴性均有干扰；故暂未建立此3味药的鉴别方法。试验表明,上述桑叶、甘草、北沙参、麦冬、枇杷叶的鉴别专属性强,重复性好,操作简便。
本试验曾以甲醇为流动相A,水相为流动相B,其中水相由水-冰醋酸(100∶1)组成,A∶B＝66∶34,试验结果显示,甘草酸铵峰与其他组分峰分离效果不理想。经过试验,采取以甲醇为流动相A,水相为流动相B,其中水相由水-冰醋酸(100∶1)组成,A∶B＝63∶37,试验结果显示,甘草酸铵峰与其他组分峰分离效果理想,出峰时间合适。
【参考文献】
[1] 肖崇厚,杨松松,洪筱坤.中药化学[M].上海：上海科学技术出版社, 1997.168－170.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.59－60.
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