作者：周安,李庆林,彭代银,吴鸿飞,范琪,王效山
【摘 要】 目的 建立藤黄中藤黄酸和新藤黄酸的含量测定方法。方法 采用反相高效液相色谱法,色谱柱为Hypersil ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇-0.1%冰醋酸水溶液(93∶7),流速1.0 mL/min；检测波长为360 nm,外标法定量。结果 藤黄酸线性范围为2.45～49 μg,回归方程Y＝11 334.8＋232 781X(r＝0.999 9,n＝5),平均回收率99.3%,RSD＝1.02%(n＝6)；新藤黄酸线性范围为2.55～51 μg,回归方程Y＝75 197.5＋226 301X(r＝0.999 7,n＝5),平均回收率100.5%,RSD＝1.48%(n＝6)。结论 本法精密度高,重复性好,简便、可靠,可作为藤黄的质量控制方法。
【关键词】 高效液相色谱法；藤黄；藤黄酸；新藤黄酸；含量测定
Key words：HPLC；Gamboge；Gambogic acid；Gambogenic acid；Content determination
藤黄系藤黄科植物藤黄Garcinia hanburyi Hook.f.所分泌出的干燥树脂,性寒,味酸、辛、涩,有毒,具破血散结、解毒、止血、杀虫之功效,用于治疗瘰疠、痈疽、疖肿等顽疾。近20年来研究发现,藤黄酸、新藤黄酸具有显著的抗肿瘤活性,医药工作者对其尤为重视。国内外特别是我国学者对藤黄及其活性成分藤黄酸和新藤黄酸的含量测定方法做了大量的研究工作,其中大部分采用TLC法和HPLC-ELSD法[1-2]。为了进一步完善中药藤黄的质量控制,本试验采用HPLC-DAD法同时对藤黄酸和新藤黄酸进行含量测定,此法简便、可靠,可作为中药藤黄的质量控制方法。
1 仪器与试药
Agilent1100高效液相色谱仪(包括G1313A自动进样器,
G1315ADAD检测器,G1311A四元剃度洗脱泵,G1316A柱温箱,色谱工作站)；BP2110电子分析天平(德国Sartorius 1/100 000)；KQ-300VDB超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。甲醇为色谱纯,水为双蒸水。藤黄酸对照品、新藤黄酸对照品均由安徽中医学院药物研究所提取分离,HPLC归一化法测定其纯度,分别为99.3%和99.9%。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：大连依利特产Hypersil ODS (5 μm,4.6 mm×250 mm)；流动相：甲醇-0.1%冰醋酸水溶液93∶7；流速1.0 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：25 ℃；进样量：25 μL。在该色谱条件下,新藤黄酸和藤黄酸的保留时间分别为5.5、7.5 min。理论塔板数按新藤黄酸计算不低于3 000,新藤黄酸和藤黄酸分离度均大于1.5。色谱图见图1。
2.2 样品溶液的制备
将藤黄原料药粉碎,过40目筛,取藤黄药材粉末0.2 g,精密称定,置于50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,超声提取20 min后,补足甲醇至刻度,精密吸取1 mL至10 mL容量瓶中,定容至刻度,经0.45 μm微孔滤膜过滤,滤液作为供试品溶液。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取藤黄酸对照品9.8 mg和新藤黄酸对照品各10.2 mg,置于10 mL容量瓶中,加甲醇定容,精密移取0.5 mL至10 mL容量瓶中,制成每1 mL分别含0.049 mg和0.051 mg的混合溶液,作为对照品溶液。
2.4 线性关系考察
精密量取“2.3”项下对照品溶液0.5、1、2、4 mL置10 mL容量瓶中,加甲醇定容,分别吸取25 μL注入液相色谱仪,在360 nm波长下测定。以峰面积积分值为纵坐标、对照品浓度(μg)为横坐标作图及回归处理,得藤黄酸和新藤黄酸回归方程,分别为：Y＝11 334.8＋232 781X,r＝0.999 9(n＝5)；Y＝75 197.5＋226 301X(r＝0.999 7,n＝5)。结果表明：藤黄酸在2.45～49 μg、新藤黄酸在2.55～51 μg范围内呈良好线性关系。
2.5 精密度考察
分别吸取“2.4”项下4 mL溶液配置成的对照液25 μL,连续进样5次,测定峰面积,外标法计算含量,计算RSD值。结果表明：藤黄酸和新藤黄酸含量的RSD分别为0.18%和0.24%,本试验进样精密度良好。
2.6 重复性试验
取同一批次样品,按供试品溶液制备方法处理样品6份,测得藤黄酸和新藤黄酸的平均含量,分别为30.87%和11.66%；RSD分别为1.1%和2.3%。
2.7 稳定性试验
室温下,精密吸取已知浓度的藤黄粗提物溶液25 μL,于0、0.5、1、2、3、4、5 h进样测定,结果藤黄酸和新藤黄酸峰面积的RSD分别为0.66%和0.94%,表明供试品溶液在5 h内稳定。
2.8 加样回收率试验
取已知含量的藤黄药材(藤黄酸30.21%、新藤黄酸11.59%)粉末约0.2 g,6份,精密加入藤黄酸及新藤黄酸含量80%、100%、120%的藤黄酸和新藤黄酸,按照“2.2”项下供试品溶液制备方法制备,回收率测定用加样样品并依法测定。结果见表1。表1 加样回收率试验结果(略)
2.9 含量测定
精密称取同一批藤黄药材0.2 g,6份,按照“2.2”项下条件制成供试品溶液,按上述色谱条件测定。结果见表2。表2 藤黄药材中藤黄酸和新藤黄酸的含量测定结果(略)
3 讨论
3.1 测定波长的选择
取“2.3”项下对照品溶液25 μL注入色谱仪,于190～400 nm扫描,结果藤黄酸最大吸收波长为217、290、363 nm,新藤黄酸最大吸收波长为214、358 nm,综合考虑选择360 nm为检测波长,藤黄酸和新藤黄酸都有良好响应。
3.2 流动相的选择
曾选用甲醇-水作为流动相,但藤黄酸和新藤黄酸出现拖尾峰,故在水的流动相中加入0.1%冰醋酸,结果藤黄酸和新藤黄酸对称度良好。
3.3 提取方法的选择
除超声方法提取外还考察了另一种提取方法：精密称取细粉0.2 g,加甲醇50 mL,回流0.5 h, 精密吸取1 mL至10 mL容量瓶,定容至刻度,经0.45 μm微孔滤膜过滤,进样,结果藤黄酸与新藤黄酸含量分别为30.89%(RSD＝2.8%,n＝3)和11.03% (RSD＝3.4%,n＝3),含量与超声方法提取并无显著性差异,但超声方法提取简便、省时。超声时间确定中,取同一批制剂分别超声10、20、30 min及1 h,结果超声20、30 min与1 h测定结果并无显著性差别。
【参考文献】
[1] 杨 虹,丛晓东,蒋王林,等.高效液相色谱-蒸发光散射检测法对藤黄中藤黄酸及其衍生物的含量测定[J].中国药科大学学报,1999,30(3)：202－205.
[2] 叶定江,吴 皓,胡 勇,等.藤黄及其炮制品中藤黄酸含量的比较[J].中国中药杂志,1995,20(10)：601－602.
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