作者：袁子民,贾天柱·,张艳秋,祖凤英
【摘 要】目的 建立商品肉豆蔻药材甲醇提取液的指纹图谱分析方法,以考察不同地区市售肉豆蔻药材质量的均一性。方法 采用高效液相色谱法,色谱柱为ZORBAX EclipseXDB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相：甲醇-乙腈-水(25∶35∶40),流速1 mL/min,柱温：30 ℃；检测波长：270 nm。以去氢二异丁香酚为参照物。结果 建立了肉豆蔻药材的指纹图谱,共有17个共有峰,指纹图谱相似度均在0.9以上。结论 不同地区市售的商品肉豆蔻药材无差异性,该法准确、可靠,为肉豆蔻药材的质量控制提供了科学依据。
【关键词】 肉豆蔻；去氢二异丁香酚；指纹图谱；高效液相色谱法
Key words：nutmeg；dehydrodiisoeugenol；fingerprint；HPLC
肉豆蔻为肉豆蔻植物肉豆蔻Myristica fragrans houtt.的干燥种仁[1]。由于受到产地来源、贮存时间不详、质量控制标准较低等原因影响,因此,肉豆蔻药材内在质量的稳定、均一、可控研究尤为重要。本试验采用高效液相色谱法(HPLC),以不同地区商品肉豆蔻药材为研究对象,建立其甲醇提取液的指纹图谱分析方法,该法简便、灵敏、准确,为肉豆蔻药材的质量标准研究提供了科学依据。
1 材料
1.1 仪器
Agilent1100高效液相色谱仪(chemistation system工作站)。
1.2 试药
去氢二异丁香酚对照品[2],沈阳药科大学提供,经高效液相色谱法面积归一化法测定,纯度>98.0%；肉豆蔻药材购于不同地区,经鉴定为肉豆蔻科植物肉豆蔻(Mystica fragrans Houtt.)的干燥种仁,肉豆蔻对照药材购于中国药品生物制品检定所,批号120926-200304。甲醇、乙腈为色谱纯,水为重蒸水。
1.3 数据处理软件
国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004)
A版(中南大学设计)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为ZORBAX EclipseXDB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相：甲醇-乙腈-水(25∶35∶40),流速1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：270 nm。
2.2 参照物溶液的制备
精密称取去氢二异丁香酚对照品适量,加甲醇制成每1 mL含去氢二异丁香酚0.10 mg的溶液,即得。
2.3 供试品溶液的制备
取肉豆蔻粉末(过40目筛)0.5 g,精密称定,置具塞三角瓶中,精密加入甲醇25 mL,称定重量,超声处理30 min,取出,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液过0.45 μm滤膜,即得供试品溶液。
2.4 检测方法
参照[《中华人民共和国药典》2005年版(一部)附录ⅥD]试验,分别精密吸取参照物溶液及供试品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,记录70 min的色谱图,即得。
2.5 精密度试验
精密吸取同一供试品溶液10 μL,在所建立的测定条件下连续进样5次,采用中药色谱指纹图谱的相似性计算软件计算,结果5次进样的色谱图其相似度均为0.9以上,表明仪器精密度良好,符合指纹图谱要求。
2.6 重复性试验
精密称取同一批样品各5分,分别按供试品溶液制备方法,精密吸取各供试品溶液10 μL,分别注入液相色谱仪,测定指纹图谱。采用中药色谱指纹图谱的相似性计算软件对5次测定结果进行计算,结果各供试品色谱图其相似度均为0.9以上,表明方法的重复性良好,符合指纹图谱要求。
2.7 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液5 μL,按0、2、4、6、8、12、24 h所建立的测定条件进行检测,采用中药色谱指纹图谱的相似性计算软件对所得结果进行计算,其相似度均为0.9以上,结果表明,在24 h内肉豆蔻的色谱指纹图谱基本稳定,没有明显的变化,符合指纹图谱的要求。
2.8 样品测定
按上述样品溶液的制备方法及测定方法,对10批不同地区商品肉豆蔻药材进行测定,记录色谱图,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统,对测定结果进行处理,得到各批次样品的相似度。结果见表1。表1 10批商品肉豆蔻药材指纹图谱的相似度（略）
2.9 指纹图谱的建立及分析(见图1～图4)
按上述方法检测10批肉豆蔻的指纹图谱,结果表明,10批肉豆蔻药材的指纹图谱有17个比较稳定的特征峰,其中4号峰为去氢二异丁香酚色谱峰。由相似度评价结果可以看出,10批不同地区商品肉豆蔻药材HPLC指纹图谱的相似度均在0.9以上,未发现离群样本。表明各药材之间相似性良好,初步说明目前各地区市售的商品肉豆蔻药材无差异性,质量较为稳定。
3 讨论
试验中对流动相进行了考察,分别采用甲醇-水(70∶30)、甲醇-乙腈-水(30∶30∶40)、甲醇-乙腈-水(25∶35∶40)为流动相,结果发现以甲醇-乙腈-水(25∶35∶40)为流动相条件下,分离度好,特征峰全面；方法学考察试验结果证明,该方法准确、可靠,可用于肉豆蔻药材指纹图谱的分析测定[3]。
供试品溶液制备时,曾对提取方法(回流、索氏提取、超声)、提取时间、提取溶剂(甲醇、乙醇、70%乙醇)进行了考察,结果采用甲醇超声处理30 min即可提取完全,方法简便、可行,且甲醇对肉豆蔻中挥发性及非挥发性成分均能提取,色谱峰较多。
去氢二异丁香酚是肉豆蔻中非挥发性成分,含量较高,具有较强的抑菌作用,为肉豆蔻中的活性成分,且性质稳定,故选择其为参照物峰,同时结合其吸收波长及色谱峰数量、分离程度,经筛选确定测定波长为270 nm。
肉豆蔻主要含有挥发油、脂肪油、木脂素类等多种有效成分,本试验采用HPLC法对其进行指纹图谱的初步研究。指纹峰不仅包含非挥发性成分,还能包含挥发性成分,化学成分检测的较多,相比采用气相色谱法,更能代表肉豆蔻化学成分的整体性。肉豆蔻药材多为进口,其产地、贮存时间等不太明确,在指纹图谱研究中发现虽然相似性均在0.9以上,但10批商品肉豆蔻药材共有指纹蜂相对峰面积变化变异较大,同时也反映不同地区商品肉豆蔻化学成分及本身个体种仁间也可能存在差异,还需进一步研究。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.90.
[2] 李秀芳,吴立军,贾天柱,等.肉豆蔻的化学成分[J].沈阳药科大学学报, 2006,23(11)：698－699.
[3] 周 欣,李章万,张雪琴,等.银杏叶片剂中银杏黄酮的HPLC指纹图谱研究[J].中国药学杂志,2006,23(11)：698－699.
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