【摘 要】 目的 建立高效液相色谱法测定蛤蚧中胆甾醇的含量。方法 采用高效液相色谱法,色谱柱：Hypersil ODS2柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相：甲醇；检测波长208 nm；柱温40 ℃；流速为1.0 mL/min。结果 胆甾醇质量在0.885～14.000 μg范围与峰面积值的线性关系良好(r＝0.999 5),平均回收率99.65%,RSD＝3.45%(n＝6)。结论 本方法简便可行、快速准确,可用于蛤蚧中胆甾醇的含量测定。
【关键词】 蛤蚧；胆甾醇；高效液相色谱法；含量测定
Key words：Gekko Gecko；cholesterol；HPLC；content determination
蛤蚧系名贵中药,具有补肺益肾、纳气定喘、助阳益精之功效,多用于治疗肺虚气喘、咳血、阳痿遗精等。现代药理研究表明,蛤蚧的脂溶性提取物有抗炎和性激素样作用。胆甾醇是脂溶性提取物中的主要成分之一,因此,从蛤蚧中分离出胆甾醇并对其进行定量测定具有重要意义。
胆甾醇的测定方法主要有吸光光度法、气相色谱法与高效液相色谱法。吸光光度法成本低,操作简单,但只能测定总甾体的含量,误差较大,重现性较差[1]；气相色谱法一般要将甾醇衍生化后再进行测定,前处理比较繁琐[2]；高效液相色谱法测定胆甾醇具有简单、快速、重现性好的特点[3]。目前,关于蛤蚧胆甾醇的含量测定方法未见报道,本试验拟建立高效液相色谱法对蛤蚧中的胆甾醇进行定量测定,为进一步探索蛤蚧的药理作用提供理论依据。
1 材料
高效液相色谱仪：LC-10ATVP色谱泵、SPD-10AVP可见紫外检测器、SCL-10ATVP控制器、CLASS-VP5.02工作站、7725型手动进样器(日本岛津公司)。紫外分光光度计UV- 2401PC(日本岛津公司)。BF-2000A氮气吹干仪(BFC八方世纪)。GL-88B旋涡混合器(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
蛤蚧药材由本院中药房提供,经鉴定为脊索动物门爬行纲壁虎科动物蛤蚧(Gekko gecko Linnaeus),药材粉碎后过40目筛。胆甾醇标准品：Sigma公司(C8667)。甲醇为色谱纯
(Fisher公司)；石油醚、无水乙醇、正己烷、氢氧化钾均为分析纯(北京化工厂)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
对胆甾醇标准溶液在200～400 nm波长处进行扫描,在208 nm处有最大吸收。色谱柱：Hypersil ODS2柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相：甲醇；检测波长208 nm；柱温40 ℃；流速：1.0 mL/min。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取胆甾醇对照品9.39 mg,置于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,即得0.939 mg/mL的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取蛤蚧粗粉约0.5 g,精密称定,置索氏提取器中,以30 mL石油醚(30～60 ℃)回流提取5 h,回收石油醚并将浸膏挥至无醚味,精密称定浸膏0.029 1 g,加入4 mL 0.5 mol/L氢氧化钾的乙醇溶液混匀,置80 ℃水浴中皂化20 min,皂化过程中每5 min涡旋30 s,以保证脂肪完全皂化,皂化液冰水中冷却,向其中加入0.8 mL蒸馏水混匀,再加入4 mL正己烷,离心2 min(500 r/min),取上层有机相,用N2吹干,残渣用甲醇0.5 mL涡旋溶解,0.45 μm有机膜过滤,收集滤液作为供试品溶液。
2.4 系统适应性考察
分别吸取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液各15 μL,按照“2.1”项下色谱条件进样测定,色谱图见图1。样品中胆甾醇得到较好分离,其色谱峰的保留时间和标准品一致。
2.5 线性关系的考察
精密吸取胆甾醇对照品溶液50、100、200、400、800、1 600 μL,用甲醇稀释成0.029、0.059、0.117、0.235、0.470、0.939 mg/mL标准溶液,按上述色谱条件进行测定,每次进样15 μL,同一浓度重复进样3次,测得峰面积。以峰面积为纵坐标、胆甾醇浓度为横坐标绘制标准曲线,通过回归计算,得到回归方程：Y＝2×10－7X－0.021 7,r＝0.999 5,线性范围0.435～14.085 μg。
2.6 精密度试验
取标准品溶液,浓度分别为0.029、0.235、0.939 mg/mL,各进样15 μL,每种溶液在同一天测定6次,并连续测定3 d,计算低、中、高3种浓度标准品溶液的日内RSD分别为3.89%、4.11%、4.04%,日间RSD分别为3.59%、4.21%、4.15%。
2.7 稳定性试验
取同一份供试品溶液,分别于2、4、6、8、10、12 h进样分析,记录胆甾醇峰面积,结果RSD＝3.65%,表明样品溶液在12 h内性质稳定。
2.8 重复性试验
取同一批蛤蚧药粉共6份,每份0.5 g,精密称量,按照“2.3”项下方法制备供试品溶液,进样测定胆甾醇峰面积,结果RSD＝2.75%,表明该条件重复性好。
2.9 回收率试验
精密称取已知含量的蛤蚧药粉(070708)6份,分别精密加入一定量的胆甾醇对照品,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,测定胆甾醇的含量,计算回收率,结果见表1。表1 回收率测定结果(略)
2.10 样品测定
取蛤蚧药粉5批,按“2.3”项下供试品溶液制备方法,按上述色谱条件进行含量测定,用外标法计算。5批样品的胆甾醇含量见表2。表2 样品中胆甾醇含量测定结果（略）
3 讨论
蛤蚧样品采用石油醚作提取溶剂,索氏提取器回流提取,并用紫外扫描的方法监测提取终点,大约5 h时提取液在紫外208 nm处无吸收,因此,确立样品回流提取时间为5 h,试验表明,该法提取完全,回收率好。
在对蛤蚧脂溶性提取物进行皂化时借鉴了微型皂化方法[4],分别考察了2、3、4、5 mL的0.5 mol/L氢氧化钾的乙醇皂化效果,确定4 mL为皂化最佳剂量。
文献报道中有用电化学检测器[5]、蒸发光散射检测器[6]的高效液相色谱法测定胆甾醇含量。本试验采用紫外检测器的高效液相色谱法,选用Hypersil ODS2色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),以甲醇作流动相就可以达到良好的分离效果,而且峰形对称,分离时间适中。本方法简单,出峰时间快,结果线形,精密度试验、回收率试验均较满意。
【参考文献】
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[2] Abidi SL. Chromatographic analysis of plant sterols in foods and vegetable oils[J]. Chromatography A,2001,935：173－201.
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[4] J Lopez-Cervantes, DI Sanchez-Machado, NJ Rios-Vazquez. High- perfomance liquid chromatography method for the simultaneous quantification of retinol,α-tocopherol,and cholesterol in shrimp waste hydrolysate[J]. J Chromatography A,2006,1105：135－139.
[5] 孙赛龙,赵志萍,谢建龙,等.高效液相色谱法检测蛋黄卵磷脂中胆甾醇的含量[J].精细化工中间体,2003,33(4)：52－53.
[6] Kazuhiro Hojo, Hideki Hakamata, Ayumi Ito, et al. Determination of total cholesterol in serum by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection[J]. J Chromatography A,2007,1166：135－141.
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