【摘 要】 目的 探讨EGb761(银杏叶提取物)对慢性脑缺血大鼠脑组织神经胶质细胞的影响。方法 将雄性SD大鼠随机分为假手术组、单纯缺血组、EGb761干预组。制备慢性脑缺血大鼠模型，药物干预12周后，免疫组化方法分别检测各组大鼠脑组织中星形胶质细胞和少突胶质细胞的表达。结果 EGb761干预组大鼠的海马、胼胝体、皮质CNPase阳性细胞表达明显高于单纯缺血组，而海马、胼胝体、皮质GFAP阳性细胞表达明显低于单纯缺血组(P<0.05)，差异有统计学意义。结论 慢性脑缺血时，EGb761对少突胶质细胞缺血性反应有保护作用，同时减少反应性星形胶质细胞增生。
【关键词】 EGb761;慢性脑缺血;少突胶质细胞;反应性星形胶质细胞增生;大鼠
【Abstract】 Objective To investigate the effects of EGb761(Ginkgo biloba extract) on neuroglial cell in chronic cerebral ischemia rats.Methods Male Sprague Dawley rats were randomly divided into sham?operated group, hypoperfusion group and EGb761 group. The models of chronic cerebral ischemia were established. Then the rats of EGb761 group were treated by intragastric administration with EGb761 for 12 weeks, the expressions of astrocytes and oligodendrocytes in the hippocampus, corpus callosum and cortex were examined by immunohistochemistry and the positive cells were counted.Results Compared with the hypoperfusion group, the number of oligodendrocytes increased and the number of astrocytes decreased significantly in the EGb761 group(P<0. 05).Conclusion EGb761 plays a protective role in oligodendrocytes ischemic reaction and decreases reactionary astrogliosis in chronic cerebral ischemia.
【Key words】 EGb761; Chronic cerebral ischemia; Oligodendrocytes; Reactionary astrogliosis; Rat
慢性脑缺血(chronic cerebral ischemia，CCI)与临床诸多脑血管疾病密切相关。慢性脑缺血时，少突胶质细胞存在易损性，而星形胶质细胞反应性增生、氧化应激和兴奋性毒性等是造成上述情况的重要原因。目前，有关标准银杏叶提取物EGb761(Ginkgo biloba extract 761)在脑缺血时对神经元保护作用的研究较多，而针对其对神经胶质细胞抗脑缺血作用的研究相对较少。本试验通过对慢性脑缺血大鼠模型给予国际标准含量的银杏叶提取物EGb761进行干预，观察其对少突胶质细胞及星形胶质细胞的影响，为慢性脑缺血的预防和治疗开辟新思路，提供实验证据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物与分组：雄性SD大鼠30只，体质量(220±30) g，由郑州大学实验动物中心提供。随机分成3组：A组为假手术组，B组为单纯缺血组，C组为EGb761干预组，每组10只。
1.1.2 药物与试剂：EGb761(达纳康，按国际标准银杏叶提取物要求选取，内含24%的银杏黄酮苷和6%的萜烯内酯，40 mg/粒)，由法国博福?益普生制药工业公司生产;GFAP抗体(胶质原纤维酸性蛋白抗体)、CNPase抗体(2’3’?环核苷酸3’?磷酸二酯酶抗体)，均购自北京博奥森生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 CCI模型鼠的制备：参考Wakita等[1]方法制备动物模型。10%水合氯醛(0.3 mg/100g)腹腔内注射麻醉后，颈部备皮、消毒，颈正中切开皮肤，切口1.5～2.0 cm，钝性分离筋膜、胸骨舌骨肌，分离出双侧颈总动脉，每侧用双线分别在近心端和远心端结扎，然后在两结扎处之间剪断颈总动脉制备出单纯缺血组和干预组模型，假手术组仅分离双侧颈总动脉而不结扎，缝合切口，对皮并消毒，放回原环境中饲养。
1.2.2 给药方法：将达纳康研成粉末状，用蒸馏水溶解并混匀，术后24 h按照0.5 ml/100 g予灌胃，单纯缺血组给予等量蒸馏水灌胃，各组灌胃均为1次/d，持续12周。
1.2.3 标本的收集与处理：大鼠经麻醉后，常规生理盐水及4%多聚甲醛灌注、固定，断头取脑，制作脑部冠状石蜡切片(厚度4 μm)，分别采用HE染色和免疫组化染色，检测脑组织病理变化和皮层、胼胝体及海马GEAP、CNPase阳性细胞数的情况。
1.2.4 统计学处理：实验数据用均数±标准差(±s)表示，SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 组织病理学表现(HE染色) 假手术组未发现明显的病理变化;单纯缺血组可见神经元大量变性、坏死，胞体呈三角形，胞浆致密，周围出现空晕，白质内出现散在的神经纤维及髓鞘溃变，表明脑组织有明显的缺血及脑白质受损表现;EGb761组神经元变性坏死及脑白质受损均较单纯缺血组减轻。
2.2 大鼠脑胶质细胞CNPase及GFAP的变化情况
2.2.1 CNPase变化情况：各组均取皮层、胼胝体、海马处进行观察并统计CNPase阳性细胞个数。单纯缺血组CNPase阳性细胞数明显少于假手术组和EGb761组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。表1 大鼠皮层、胼胝体、海马CNPase阳性细胞表达情况 注：单纯缺血组与假手术组比较，*P<0.01;单纯缺血组与干预组比较，◆P<0.01
2.2.2 GFAP变化情况：各组均取皮层、胼胝体、海马处进行观察并统计GFAP阳性细胞数。单纯缺血组GFAP阳性细胞数明显多于假手术组和EGb761组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。表2 大鼠皮层、胼胝体、海马GFAP阳性细胞表达情况注： 干预组与单纯缺血组比较，◆P<0.01;单纯缺血组与假手术组比较，*P<0.01
3 讨论
少突胶质细胞(oligodendrocyte，OLG)是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，在发生缺血缺氧性损伤后对神经系统正常功能的发挥产生严重的影响。而星形胶质细胞是中枢神经系统内在数目占绝对优势的一类胶质细胞, 被认为在神经元的整个发育过程中起重要作用[2]，它参与中枢神经系统内神经元功能的调节，在维持神经元的生存微环境中起着重要的作用。缺血性脑损伤后星形胶质细胞增生并产生许多生物活性物质， 对缺血损伤神经元具有保护作用;而过度增生可作为机械屏障影响髓鞘和轴索的再生，从而影响周围神经组织的结构修复和功能恢复。国际标准EGb761，含24%的银杏黄酮苷和6%的萜烯内酯等多种活性物质，现已证实，EGb中银杏黄酮为自由基清除剂， 银杏内酯为特异性PAF 受体阻滞药，对缺血时的神经元有保护作用。
本实验采用CNPase、GFAP分别标记少突胶质细胞和星形胶质细胞，应用EGb761对慢性脑缺血大鼠灌胃治疗，观察大鼠脑内少突胶质细胞及星形胶质细胞数量的变化。
OLG对缺血性损伤高度敏感性的机制包括氧化应激、兴奋性氨基酸和凋亡通路激活等[3]。(1)OLG中铁含量高，而谷胱甘肽含量却较低，清除自由基能力弱而且显著依赖于氧化磷酸化，因此容易受到氧化应激损伤[4]。另外，胶质细胞比神经元更易发生铁和铝的蓄积，加重氧化应激。许多体内外实验已证实EGb761能够清除自由基。EGb761通过抑制细胞氧自由基的释放削弱超氧自由基对少突胶质细胞的攻击，同时增强细胞抗缺氧能力。(2)OLG表达功能性谷氨酸的非NMDA受体，包括红藻氨酸受体和AMPA受体，故其对兴奋性氨基酸易感[5]。且OLG缺氧缺血时产生兴奋性损伤，胞内Na+的浓度急剧增高，局部谷氨酸浓度显著增加使AMPA、Kainate 受体过度活化，从而介导Ca2+内流增加，导致细胞内Ca2+超载。EGb761可抑制非竞争性NMDA受体，又能作用于谷氨酸受体活化水平，抑制受体活化后引起的一系列级联活化和离子通道的开放，从而对抗兴奋性氨基酸的神经毒性和Ca2+超载对细胞的损伤。(3)OLG含有丰富的神经鞘磷脂和酞基鞘氨醇，这两种化合物在体外试验中均可诱导细胞凋亡[6]。在利用黄嘌呤诱发PC12细胞凋亡模型，Zhou等[7]发现银杏内酯能削弱由黄嘌呤诱导的p53、c?Myc、Bax和Caspase?3蛋白酶等多种重要凋亡因子的表达，直接证实银杏内酯可拮抗细胞凋亡，并可在凋亡早期阻断其进程。结合本实验结果，EGb761干预组脑组织中的少突胶质细胞数量较单纯缺血组明显增加(P<0.01)，提示EGb761的确能够减轻OLG在慢性脑缺血时的损伤。
星形胶质细胞在缺血性脑损伤后增生并产生的生物活性物质反过来又可引起星形胶质细胞损伤和功能障碍。它们包括谷氨酸、钾、乳酸、花生四烯酸、NO 和Ca2+流量变化等。所有这些因子都能影响星形胶质细胞， 而星形胶质细胞功能发生障碍则可影响神经元存活[8]。反应性星形胶质细胞增生在一定程度上反映了脑缺血缺氧的程度。EGb761能够针对反应性星形胶质细胞增生的多种损伤机制进行干预。实验结果显示反应性星形胶质细胞增生的情况较单纯缺血组明显改善(P<0.01)，提示EGb761能抑制脑缺血时星形胶质细胞的过度表达。
脑损伤的病理生理改变存在诸多环节，如氧自由基、Ca2+超载、兴奋性氨基酸毒性作用和生物膜损伤等，只要针对其中某一环节施加干预都将打断级联反应而保护神经细胞。EGb761作用的多重性与慢性脑缺血中的病理生理反应多样性相对应，从而对慢性缺血的脑起保护作用。由于慢性脑缺血所致脑损伤除了氧自由基损伤、脂质过氧化和兴奋性毒性外，还涉及其他因素，尽管EGb761确实有神经保护作用，但其保护OLG缺血性损伤及抑制星形胶质细胞过度增生的确切机制仍需深入研究。
【参考文献】
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[8] 熊晖, 梁卫兰. 围产期缺氧缺血性脑损伤中星形胶质细胞的病理生理改变[J]. 生理科学进展, 2000, 3: 217?221.
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