重组人生长激素对脑缺血/再灌注损伤细胞凋亡及Nestin表达的影响

人气指数:点发布时间:2011-06-09 22:09 来源：http://www.zgqkk.com 作者：中国期刊库

分享到：

作者：刘海涛白宏英曾志磊郭耀强方李鸿

【摘要】目的观察重组人生长激素(recombinant human growth hormone， rhGH)对脑缺血/再灌注(ischemia?reperfusion， I/R)损伤后神经元细胞凋亡及Nestin表达的影响。方法 54只SD雄性大鼠随机分成3组：假手术组、对照组(脑缺血/再灌注+生理盐水组)、治疗组(脑缺血/再灌注+重组人生长激素)，每组18只。应用线栓法制作大鼠脑缺血/再灌注损伤模型，大脑中动脉缺血2h，分别在再灌注7d、14d、21d后处死，采用TUNEL法，免疫组织化学法检测顶叶皮质内7d、14d、21d的神经元凋亡和巢蛋白(Nestin)的表达。结果应用重组人生长激素干预后顶叶皮质在7d、14d、21d神经元凋亡数较大鼠对照组明显减少，Nestin的表达显著增加。结论 rhGH的神经保护作用可能与抑制缺血神经元细胞凋亡和上调Nestin的表达有关。

【关键词】缺血/再灌注;TUNEL;重组人生长激素;Nestin

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of the recombinant human growth hormone (rhGH) on apoptosis and the expression of Nestin in male SD rats with cerebral ischemia?reperfusion injury. Methods The middle cerebral artery ischemia?reperfusion injury model was established by middle cerebral artery occlusion (MCAO) with nylon suture. Fifty?four rats were randomly divided into 3 groups: the sham group (n=18)， the control group (n=18) and the treatment group (n=18). We used TUNEL and immunohistochemical method to detect TUNEL?positive apoptotic cells and the expression of Nestin in cortex of parietal lobe on the 7th， 14th and 21st day after ischemia?reperfusion injury. Results TUNEL?positive apoptotic cells were decreased in treatment group on the 7th，14th and 21st day， and the expression of Nestin was increased obviously in cortex on the 7th， 14th and 21st day. Conclusion rhGH could inhibit neural apoptosis and increase the expression of Nestin involved in the neuroprotection of rhGH.

　　【Key words】 Ischemia?reperfusion; TUNEL; rhGH; Nestin

　　神经细胞损伤过程中，缺血/再灌注损伤与细胞的凋亡有着密切关系[1]，而细胞凋亡起着重要作用，可能是其主要机制之一[2]。研究发现生长激素具有抗凋亡、抗炎，促进新生血管生成等作用，其在心血管系统、消化系统、烧伤及缺血缺氧脑病方面均已证实。目前，生长激素在脑缺血/再灌注损伤中对细胞凋亡和促进神经干细胞增殖影响的研究较少。本实验通过生长激素对局灶性大鼠脑缺血/再灌注损伤模型的干预，观察其在缺血/再灌注损伤7d、14d、21d顶叶皮质细胞凋亡和Nestin的表达情况。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组选用健康雄性SD大鼠，体质量250～280g(由郑州大学实验动物中心提供)，术前12h禁食，术前4h禁水。随机分为假手术组、对照组(脑缺血/再灌注+生理盐水组)、治疗组(脑缺血/再灌注+重组人生长激素组)3组，每组18只，各组间体质量无明显差异(P>0.05)。

　　1.2 主要试剂和药物重组人生长激素(长春金赛药业生产)，TUNEL检测试剂盒及Nestin鼠单克隆抗体购自美国 SANTA CRUZ公司。

　　1.3 大鼠脑缺血/再灌注损伤模型的建立及处理制作大鼠局灶性脑缺血/再灌注采用改良的Longa[3]线栓法损伤模型。参照其5级4分制评分标准，将入选的动物，分笼饲养，室温维持20℃左右，正常喂食。治疗组在脑缺血/再灌注损伤模型成功后开始颈部皮下注射重组人生长激素0.1U/(kg·d)，1次/24h，连续注射1周。对照组注射同样剂量生理盐水，注射时间、部位及次数同治疗组。

　　1.4 组织切片与免疫组化染色各组分别在造模成功后7d、14d、21d麻醉后以4%多聚甲醛进行组织固定。断头后剥离出脑组织常规固定、石蜡包埋和切片。常规脱蜡、水化，按试剂盒提供的实验步骤进行操作，DAB显色，光镜下观察，胞浆出现棕色颗粒为阳性着色。

　　1.5 免疫组化结果分析应用德国Lecia显微照像系统(上海山富科学仪器有限公司)进行图像采集，用Biosens Digital Imaging Systems， v1.6图像分析系统在顶叶区分别随机采集10个视野(400倍)，计数分析切片顶叶区TUNEL阳性细胞数和计算Nestin 染色阳性细胞平均灰度值。

　　1.6 统计学处理各组资料结果以(±s)表示，采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，各组数据用单因素方差分析，LSD?t法进行两两比较，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　治疗组和对照组在7d、14d、21d脑皮质Nestin的平均灰度值的变化：治疗组脑皮质Nestin的平均灰度值均较同时相的对照组显著增加(P<0.05)，见表1。表1 各组7d、14d、21d Nestin的平均灰度值注：◆1组与对照组同一时间点比较，P<0.05;△与假手术组同一时间点比较，P<0.05，1组治疗组和对照组在7、14、21d脑皮质TUNEL阳性细胞数的平均值变化：治疗组脑皮质TUNEL阳性细胞数的平均值较同时相的对照组显著的减少(P<0.05)，见表2。表2 各组7d、14d、21d TUNEL阳性细胞数注:◆1组与对照组同一时间点比较，P<0.05;△与假手术组同一时间点比较，P<0.05

　　3 讨论

　　生长激素(growth hormone，GH)是由垂体前叶嗜酸细胞所分泌的191氨基酸的非糖基化蛋白。脑垂体前叶50%的细胞是嗜酸细胞，它所分泌的激素主要是生长激素，其主要功能是促进机体的生长，减少蛋白质的消耗，同时GH与神经内分泌和免疫系统有着密切的联系。GH作为神经内分泌系统与免疫系统之间的“共同语言”，在神经内分泌网络中起着重要的调节作用。研究发现[4]， GH还可能通过抑制酪氨酸磷酸化和干扰素?γ所启动的信号转导途径下调诱生型一氧化氮合酶的产生，从而减少细胞毒作用，甚至可以抑制LPS 诱导单核细胞产生TNF?α，从而减轻炎症反应[5]，这对减轻脑缺血/再灌注损伤后的炎症反应，减少神经功能的损害可能有一定的益处，但减少细胞的凋亡和促进神经干细胞的增殖的研究较少。

　　本实验发现生长激素治疗组TUNEL阳性细胞数在7d、14d、21d时均明显少于同一时相的对照组，这表明在缺血/再灌注损伤过程中GH有抑制细胞凋亡的作用;生长激素治疗组Nestin的平均灰度值分别在7d、14d、21d时均较同一时相的对照组明显增加，我们推测GH可能具有促使神经干细胞增殖的作用。目前对GH的抗凋亡机制尚有争论。一些研究者认为GH是通过启动丝苏氨酸激酶活性来抑制细胞凋亡的发生[6]，而其他学者认为可能是通过NF?kappaB介导的信号转导途径产生抗凋亡蛋白bcl?2和BAG?1[7?8]来抑制细胞的凋亡。而Shin等[9]认为GH是通过下调bax和bad的表达水平而不是上调bcl?2来减少细胞的凋亡。另外GH还具有抑制caspase?8作用，减少LDH的释放和抑制caspase?3的活性[10]。总之，GH具有抑制细胞凋亡的作用，且能够增加神经元细胞的数量[11?12]，使神经祖细胞的数量增加[13]。Christophidis等[14]研究认为GH不仅可以使细胞数目增加，而且使干细胞数目增多，并转化为神经元细胞，神经干细胞的增殖与GH存在剂量依赖性。

　　本研究结果显示，在大鼠脑缺血/再灌注损伤后给予rhGH治疗，可抑制脑缺血/再灌注损伤后细胞的凋亡，促进细胞的存活和神经干细胞增殖，从而减少神经元细胞的损伤和促进神经元细胞的修复，其具体机制和对神经功能的影响尚不清楚，有待进一步研究，但这可能为临床治疗提供一个新的思路和方法。

【参考文献】

　[1] 王建平，刘春岭，李昕.17?β雌二醇对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡影响的实验研究[J].中国实用神经疾病杂志，2006，9(1)：5?7.

　　[2] Choi DW.Ischemia?induced neuronal apoptosis [J].Curropin Neurobiol，1996，6(5): 667?672.

　　[3] Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1): 84?91.

　　[4] Sekine N， Fukumoto S， Ishikawa T， et al. GH inhibits interferon?ganrma?induced signal transducer and activator of transcription?1 activation and expression of the inducible isoform of nitric oxide synthase in INS?1 cells[J]. Endocrinology，2001，142 (9): 3909?3916.

　　[5] Haeffner A， Thieblemont N， Deas O， et al. Inhibitory effect of growth hormone on TNF?alpha secretion and nuclear fac?tor?kappaB translocation in lipopolysaccharide?stimulated human monocytes [J].J Immunol， 1997，58 (3):1310?1314.

　　[6] Costoya JA ， Finidori J， Moutoussamy S， et al. Activation of growth hormone receptor delivers an antiapoptotic signal:evidence for a role of Akt in this pathway [J].Endocrinology，1999，140 (12): 5937?5943.

　　[7] Jeay S， Sonenshein GE， Postel?Vinay MC， et al. Growth hormone prevents apoptosis through activation of nuclear factor?kappaB in interleukin?3?dependent Ba/ F3 cell line [J]. Mol Endocrinol，2000，14 (5): 650?661.

　　[8] Jeay S， Sonenshein GE， Kelly PA， et al. Growth hormone exerts anti?apoptotic and proliferative effects through two different pathways involving nuclear factor?kappaB and phosphatidylinositol 3?kinase [J].Endocrinology，2001，142 (1): 147?156.

　　[9] Shin DH， Lee E， Kil JW， et al. Protective effect of growth hormone on neuronal apoptosis after hypoxia?ischemia in the neonatal rat brain [J].Neuroscience Lett，2004，354(1): 64?68.

　　[10] Svensson AL， Bucht N， Hallberg M， et al. Reversal of opiate?induced apoptosis by human recombinant growth hormone in murine foetus primary hippocampal neuronal cell cultures [J].Proc Natl Acad Sci USA， 2008，105(20): 7304?7308.

　　[11] Azcoitia I， Perez?Martin M， Salazar V， et al. Growth hormone prevents neuronal loss in the aged rat hippocampus[J].Neurobiol Aging，2005，26(5): 697?703.

　　[12] Perez?Martin M， Salazar V， Castillo C， et al.Estradiol and soy extract increase the production of new cells in the dentate gyrus of old rats.[J].Exp Gerontol，2005， 40(5): 450?453.

　　[13] Aberg ND， Johansson I， Aberg M， et al.Peripheral administration of GH induces cell proliferation in the brain of adult hypophysectomized rats[J].J Endocrinol，2009，20(1): 141?150.

　　[14] Christophidis LJ， Gorba T， Gustavsson M， et al.Growth hormone receptor immunoreactivity is increased in the subventricular zone of juvenile rat brain after focal ischemia: A potential role for growth hormone in injury?induced neurogenesis[J].Growth Horm IGF Res，2009，19 (6): 497?506.

期刊库（http://www.zgqkk.com），是一个专门从事期刊推广、投稿辅导的网站。
　　本站提供如何投稿辅导，寻求投稿辅导合作，快速投稿辅导，投稿辅导格式指导等解决方案：省级投稿辅导/国家级投稿辅导/核心期刊投稿辅导//职称投稿辅导。

　　【免责声明】本文仅代表作者本人观点，与投稿辅导_期刊发表_中国期刊库专业期刊网站无关。投稿辅导_期刊发表_中国期刊库专业期刊网站站对文中陈述、观点判断保持中立，不对所包含内容的准确性、可靠性或完整性提供任何明示或暗示的保证。请读者仅作参考，并请自行承担全部责任。

重组人生长激素对脑缺血/再灌注损伤细胞凋亡及Nestin表达的影响

投稿辅导服务咨询与期刊合作加盟

期刊推荐