摘要:从H37Rv基因组中扩增Mr38 000 蛋白基因并高效表达和纯化。用PCR技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增Mr 38 000蛋白序列，将其与pGEM-T-Easy 载体连接转化E.coli DH5α，构建重组克隆载体pGEM-T-Easy/ Mr 38 000，测序正确后将目的基因片断克隆入pQE-80L原核表达载体并转化E.coli DH5α，IPTG诱导目的蛋白表达。 经Western-blot 鉴定目的基因与(His)6融合表达，将已表达的蛋白质通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化。PCR得到结核分枝杆菌Mr 38 000蛋白基因，测序结果与GeBank 中报道的完全一致。SDS-PAGE显示， 在Mr为38.5×103处有相应的蛋白质表达条带，Wesern blot鉴定为(His)6融合表达蛋白。经Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化后可得到纯化的蛋白。成功克隆了铁调节蛋白基因Mr38 000 蛋白序列，并在E.coli DH5α高效表达，亲和层析后获得了纯化目的蛋白。

关键词:Mr 38 000蛋白; 表达; 纯化; 结核分枝杆菌；

Cloning, Expression and Purification of Mr 38 000 protein
from Mycobacterium tuberculosis
ZHANG Ming， LI Jin-cheng， LIN Hang
(Department of internal neurology, 2. emergency department, the Fu Zhou general hospital, Fu Zhou, 350025, P. R. China)
[Abstract] To obtain Mycobacterium tuberculosis Mr 38 000 protein from H37Rv-DNA, express efficiently in E. coli and purify the Mr 38 000 proteins. Mr 38 000 protein gene was amplified by PCR from the genome of H37Rv and cloned into pGEM-T-Easy vector. After sequenced, Mr 38 000 protein gene was recombinated expression vector pQE-80L by restriction enzyme digestion, named pQE-80L-Mr 38 000. The plasmid pQE-80L-Mr 38 000 was transformed into E.coli DH5α and induced by IPTG. Mr 38 000 protein expression was analyzed by SDS-PAGE and confirmed by western blot with mice-specific mAb against (His)6. Mr 38 000 protein gene was identical with GeBank reported. The pQE-80L-Mr 38 000 vector expressed protein with relative molecule weight about 38.5 kD, which could be caught by (His)6 mAb. The expressed protein could be purified by Ni-NTA system kit with denative condition. Mr 38 000 protein gene had been successfully cloned and efficiently expressed in E.coli, The results established the basis for further study of the function of Mr 38 000 protein.
[Key words] Mr38 000 protein; expression; purification; Mycobacterium tuberculosis (MTB)
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）是结核病(tuberculosis, TB)的病原体。其在患者体内主要为细胞内生长。诊断方法的欠缺是结核病流行的重要原因。 目前常用的PPD试验，常使BCG疫苗接种者被误检为阳性[1]，且对后期结核患者敏感性较低，存在明显不足。近年来， 有研究发现Mr 38 000 蛋白具有强的免疫原性，而成为结核分枝杆菌抗原的研究热点[2, 3]，可能成为结核病血清学诊断试剂和疫苗研究的候选抗原之一。为此，我们在原核表达载体中表达结核分枝杆菌 Mr 38 000蛋白并对其进行了纯化，为进一步研究其抗原性和主要功能提供方便。
１　材料和方法
1.1材料 　MTB毒株H37Rv、 DH5α由本室保存; pGEM-T-Easy及Wizard Plus Purification system购自Promega公司；X-gal， 限制性内切酶BamHⅠ, EcoRⅠ及T4-DNA连接酶，TaqDNA聚合酶均为TaKaRa公司产品；IPTG, DTT, DTE, 小量质粒提取试剂盒均为Sigma公司产品，胶回收试剂盒为Vitagene公司产品。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成 根据已发表的MTB H37Rv全基因组Mr 38 000 蛋白基因序列设计引物。上游引物P1: 5’-AGGGGATCCGCGAAAATTCGTTTGCATACGCT-3’，含BamHⅠ酶切位点和起始密码子， 下游引物P2:5’-GATGAATTCACGGAGGTTGCTGTCGCGTGGTG-3’ 中加入EcoRⅠ酶切位点。引物由上海生工生物技术有限公司合成。
1.2.2 Mr 38 000片段的扩增 取保存于改良罗氏培养基的MTB H37Rv接种于7H9液体培养基，37℃间或振荡培养2~3 wk。取5mL液体培养物的菌体沉淀重悬于50μL裂解液（10╳PCR绶冲液5μL, 45 g/L吐温， 5μL, 45 g/L, NP-40 5μL，20 g/L蛋白酶K 0.5μL及水34.5μL）中。于55℃水浴1 h，沸水浴10 min灭活蛋白酶K，离心取上清，用酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于50μL TE中， 作为DNA模板。PCR反应体系为：10╳buffer 5μL, dNTPs 5μL (2.5mmoL/L)、DNA模板为1μL，P1，P2 引物各1μL (25μmoL/L)及Taq酶1μL，加水至50μL。PCR条件：94℃变性40 s，60℃复性30 s，72℃延伸1.5 min， 30个循环。
1.2.3 PCR产物的克隆与鉴定 PCR产物用琼脂糖凝胶电泳回收DNA条带。取纯化的PCR产物与质粒pGEM-T-Easy进行连接反应，转化感受态DH5α， 均匀涂布于含有x-gal (33μL) 和异丙基β-D硫代半乳糖苷IPTG (20μL)的LB培养皿中，37℃培养16 h， 挑取白色菌落进行酶切鉴定，所获阳性克隆命名为pGEM-T-Easy- Mr 38 000，送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定。
1.2.4 目的蛋白的诱导表达 经BamHI和EcoRⅠ双酶切后与经同样酶切的pQE-80L载体进行连接反应， 转化感受态DH5α，挑取的阳性克隆命名为pQE-80L -Mr38 000。在含有氨苄青霉素（100mg/L）的LB培养基中过夜培养pQE-80L- Mr 38 000。按10%的接种量进行转接，37℃摇菌3 h，加入异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5 mmoL/ L，37℃继续培养4~5 h。取1.5 mL细菌培养物，8000 g离心30 s收集菌体，加入2╳样品缓冲液剧烈振荡混匀，100℃, 5 min；8000 g离心5 min；取上清进行 SDS-PAGE电泳检测。
1.2.5 目的蛋白的Western blot分析 将经诱导的pQE-80L-Mr 38 000和E.coli DH5α分别制样，进行12% SDS-PAGE后以0.15 mA恒流电转2 h至硝酸纤维素膜上，用50 g /L脱脂奶封闭2 h，PBS洗涤后加抗His的单克隆抗体(1:5000稀释) 4℃过夜，PBS洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育1 h。PBS洗涤后DAB显色观察结果。

1.2.6 目的蛋白的可溶性分析 大规模培养细菌，诱导表达目的蛋白，收集细菌，超声破菌。离心后将上清和沉淀分别制样，进行SDS-PAGE分析。
1.2.7 目的蛋白的纯化 根据Ni-NTA试剂盒的说明书， 将融合蛋白与NI-NTA结合， 用不同pH值咪唑溶液进行洗脱， 得到纯化产物。
2 结果
2.1 Mr38 000 蛋白片段的扩增及序列测定 经30个循环PCR扩增，可得与预计长度相等的片断（图1）。 将DNA回收后插入pGEM-T-Easy载体，经测序证实所扩增的Mr 38 000 序列与GeBank数据库所收录的Mr 38 000 序列完全一致。
M: DNA marker DL2000; 1: Mr 38 000 基因PCR产物;
图1 PCR扩增Mr 38 000 蛋白基因产物琼脂糖凝胶电泳（10g/L）结果
2.2 表达载体的构建 pQE-80L经BamHI和EcoRⅠ双酶切后与Mr 38 000基因目的片断进行连接反应后，转化感受态E.coli DH5α。 挑取的克隆子进行酶切鉴定，切出约1151 bp大小片段的为阳性克隆子(图2)，命名为pQE-80L- Mr 38 000。
M: DNA marker DL 2000; 1, 2: pQE-80L –Mr 38 000;
图2 pQE-80L- Mr 38 000重组质粒BamHI和EcoRⅠ双酶切鉴定结果
2.3 Mr 38 000蛋白在pQE-80L表达载体中的诱导表达 将pQE-80L-Mr 38 000经37℃活化过夜，经IPTG诱导表达后做SDS-PAGE分析，从电泳图中可以看出在Mr为38.5╳103一致处出现了一条表达带，表达量约占菌体总蛋白的20%(图 3)。

M：蛋白分子量 marker; 1: 未诱导的pQE-80L- Mr 38 000质量重组菌E.coli DH5α;
2-4: 诱导的pQE-80L- Mr 38 000质量重组菌E.coli DH5α;
图3 (His)6-Mr 38 000 融合蛋白的SDS-PAGE分析
2.4 目的蛋白的鉴定 所构建的重组质粒表达的Mr 38 000 蛋白以带有 6个组氨酸的融合蛋白的形式出现，使用鼠抗 (His)6 mAb验证Mr 38 000 蛋白的表达。结果显示在Mr为38.5×103处有一显色带，而对照无相应条带(图4)。

M：蛋白分子量 marker; 1 : (His)6-Mr 38 000 protein expression 2. DH5α
图4 (His)6-Mr 38 000融合蛋白的Western blot分析结果
2.5 目的蛋白的可溶性分析 将上清和沉淀分别所制样品，进行SDS-PAGE分析表明表达产物主要在细菌裂解后的沉淀中， 而上清中则很少(图5)。

M：蛋白分子量 marker; 1 : 未诱导的pQE-80L- Mr 38 000质量重组菌E.coli DH5α；
2：诱导菌超声裂解后沉淀; 3: 诱导菌超声裂解后上清;
图5 (His)6-Mr38 000融合蛋白的可溶性分析
2.6 目的蛋白的纯化 纯化的产物经SDS-PAGE分析可在Mr为38.5╳103处得到一条清晰的条带(图 6)。

M：蛋白分子量 marker; 1: 未诱导的pQE-80L- Mr 38 000质量重组菌E.coli DH5α;
2: 诱导的pQE-80L- Mr 38 000质量重组菌E.coli DH5α; 3, 4: (His)6-Mr 38 000 纯化蛋白
图6 (His)6-Mr 38 000融合蛋白的表达及纯化
3 讨论　
Mr 38 000蛋白是一种磷酸盐转运蛋白，含有对结核分枝杆菌特异单克隆抗体定位的7个表位，具有较强的抗原性，已经得到了结核病研究学者们的一致认可。1992年，Bothamley[4]等认为Mr 38 000蛋白是研究菌阴性肺结核最有用的抗原之一。2006年Mark[5]等通过蛋白质基因芯片和病人血清筛选，发现Mr 38 000蛋白是空洞性肺结核所特有的蛋白抗原。
本实验中应用的pQE-80L表达载体为4751bp，起始码下游接有6个组氨酸，双链环状，Amp抗性，多克隆位点有17个单一限制性酶切位点。PCR产物共有约1150 bp，与Mr 38 000 蛋白基因大小相符合。Mr 38 000克隆入pQE-80L载体中与6个组氨酸融合，可产生共约390个氨基酸的融合蛋白，Mr为38.5×103左右，实验结果与理论值相符合。融合蛋白有(His)6的表达，因此通过检测组氨酸的表达，可间接证明Mr 38 000 蛋白表达，同时(His)6的表达为进一步纯化蛋白提供了亲和位点，它可与Ni+特异性结合，通过Ni-NTA亲和色谱柱可得到纯化的目的蛋白。
我们在原核表达系统中成功表达结核分枝杆菌的Mr 38 000蛋白， 并进行了初步鉴定和纯化，为下一步深入研究Mr 38 000蛋白的功能奠定了基础。
参考文献:
[1]Britton WJ,Palengira. Improving vaccines against tuberculosis [J]. Immunal Cell Biol, 2003: 81(1): 34—45.
[2]World Health Organization Global Tuberculosis Control-Surveillance, Planning, Financing,WHO Repot 2005, World Health Origanization, Gengeva.
[3]Laal S, Skeiky Y A. Immune-based methods, in Tuberculosis and the Tubercle Bacillus[J]. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C. 2005, 71—83.
[4]Bothamley G H, R Rudd, F Festenstein. Clinical value of the measurement of Mycobacterium tubercuosis specific antibody in pulmonary tuberculosis [J]. Zthorax, 1992, 47: 270—275.
[5]Mark J, Sartain, Rlayden A, et al. Disease State Differentiation and Identification of Tuberculosis Biomarkers Via Native Antigen Array Profiling [J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2005, 5: 2012—2113.
J359-120716-0030

 

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