2.2 基于新技术的生物学活性测定方法
    2.2.1 表面等离子共振效价测定法
    表面等离子共振现象是发生在两种折射率不同的介质界面上的一种光学现象，最早于1902年由Wood发现，并由Otto和Kretschmann等在1968年对其原理进行了详尽的阐述。简单而言，当光源的一束入射光从高折射率介质(如玻璃)射向低折射率介质(如溶液)的界面时，如果入射角大于一定的临界角，入射光将会被100%地反射至光源的同一侧，这叫做全内反射现象。当两种介质之间有一层极薄的金属膜(最为常见的50nm金膜)，这时入射光的能量将会引起金膜中等离子体的共振并以一种电磁场(称作消逝波)的方式弥散至低折射率介质一侧(如溶液)[8]，从而导致反射光的能量在某个特定的角度降至最低，这一角度被称作SPRdip角。
    表面等离子共振作为一种生物传感器技术广泛地应用于分子相互作用分析领域，当分子间发生结合或者解离时，会定量改变金膜表面附近分子的浓度，从而导致金膜附近折射率的变化，进而导致SPRdip角的改变，通过实时监测SPRdip角度的变化，就可以实时分析分子间的结合与解离过程。该技术无需预先标记荧光、二抗的分子，避免了标记基团对分子构象的影响，从而反映出分子间真实的结合性质;该技术样品消耗量低，一般仅有微克级;除了获取一般的亲和力信息外，还能够给出对阐述分子间结合机理更为宝贵的动力学信息。SPR技术已广泛应用于小分子制药和生物制药领域。
    2.2.2 均相时间分辨荧光
    均相时间分辨荧光是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法，也是用来研究药物靶标的理想平台。
该技术结合了荧光共振能量转移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer，FRET)和时间分辨荧光(Time-ResolvedFluorescence，TRF)两种技术。这种结合将FRET的均相实验方式和TRF的低背景特点融合在一起，使得HTRF技术拥有操作简单、灵敏度高、通量大、实验数据稳定可靠、假阳性率较低的优势。在HTRF实验中，当供体和受体相离很近时，在供体和受体之间会有荧光共振能量转移而产生信号。采用双波长检测能够显著减小缓冲液和培养基的干扰，最终的信号与产物形成的量成比例。HTRF技术进入药物研发领域以来，加快了很多基于抗体的研究，HTRF技术也可以取代大部分ELISA，因为HTRF具有同等的检测范围和检测极限，而且更节省实验时间，并且不需要洗板的步骤，所以该技术近年来已被应用于抗体的活性检测。例如，抗肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)[10]单抗的结合活性测定就是一种竞争性抑制受体-配体结合的效价测定。
    通过镧系元素螯合物均相时间分辨荧光法(LANCEHTRF)测定抗HGF单抗与HGF结合，并阻止HGF结合至其受体的能力。在测定中，将铕标记的HGF受体(hu-HGFR-Eu)结合至生物素标记的HGF(biotin-huHGF)，后者结合至链霉亲和素-别藻蓝蛋白(SA-APC)。该结合诱导铕和APC分子接近，而使荧光发生共振能量转移，通过具有检测HTRF功能的酶标仪进行检测。抗HGF单抗能够抑制biotin-huHGF结合至hu-HGFR-Eu，并阻止能量转移，因此降低了荧光信号输出，即抗体的量与产生的荧光量呈负相关。
    2.2.3 Alpha技术
    该技术既可用于检测细胞内各个Biomarker，也可进行各类分子相互作用研究，简单可靠。近年来，Alpha技术也应用于抗体的活性检测，该技术主要含有两种微珠，一种为供体，另一为受体。当供体微珠所带有的抗原分子(A)与受体微珠所带有的抗体分子(B)距离非常接近时，可以使用680nm激发光去引发其表面所带有的光敏感物质，使其催化周围的氧分子形成活化态，产生效率可达每秒60000个氧分子活化态产生，借此将讯号放大，此活化态氧分子再与邻近的受体微珠上的二甲基噻吩化合物产生化学冷光反应，产生冷光效应(波长大约370nm)，此冷光进一步借由能量转换激发让受体微珠产生520～620nm的发散光荧光信号，由于氧分子活化态非常不稳定，此反应相当快速仅4μs，加上若此二种微珠距离超过200nm，反应随之下降，所以只有抗原抗体分子结合才能触发反应，通过测定荧光量来反映抗体的活性。
    2.2.4 荧光染料标记法
    荧光染料标记法具有灵敏度高、选择性高、方法简便快捷、样品用量少等优点，已经广泛地应用于生物、化学、医药、卫生、农业、环境保护等领域中。应用在抗体活性检测中，荧光染料可以标记分子或细胞。
    2.2.4.1 荧光染料标记细胞
    荧光染料作为荧光检测分析方法的载体，其性能的优劣直接决定了检测方法的可行性及灵敏性。Calcein-AM(钙黄绿素-AM)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性。因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内，发出强绿色荧光。
    与其它同类试剂(如BCECF-AM和Carboxy-fluoresceindiacetate)相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去标记活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein(钙黄绿素)不会抑制任何的细胞功能，如增殖或趋化性等。
    2.2.4.2 荧光染料标记分子
    BODIPY(氟化硼二吡咯)类荧光染料作为一类新型的荧光染料，因其良好的光物理性质，在过去的二十年内得到广泛的研究。与其它的荧光染料相比，BODIPY类荧光染料具有较窄的吸收和发射峰、较高的摩尔吸光系数、较高的光稳定性和化学稳定性以及较高的荧光量子产率等。
    例如，抗PCSK9单抗的的生物活性测定即是用BODIPY标记的低密度脂蛋白(LDL)通过HepG2细胞来测定其生物活性。PCSK9是前蛋白转化酶枯草溶菌素9，能与低密度脂蛋白受体(LDLR)直接结合，促使LDLR内化和降解。降低肝细胞上LDLR的数量能够降低肝脏从循环中清除LDL的能力。抗PCSK9抗体能够与PCSK9结合，阻滞PCSK9与LDLR结合，增加LDLR数目，从而增加HepG2细胞中BODIPY标记的LDL荧光量。

---

期刊库（http://www.zgqkk.com），是一个专门从事期刊推广、投稿辅导的网站。
　　本站提供如何投稿辅导，寻求投稿辅导合作，快速投稿辅导，投稿辅导格式指导等解决方案：省级投稿辅导/国家级投稿辅导/核心期刊投稿辅导//职称投稿辅导。

---

　　【免责声明】本文仅代表作者本人观点，与投稿辅导_期刊发表_中国期刊库专业期刊网站无关。投稿辅导_期刊发表_中国期刊库专业期刊网站站对文中陈述、观点判断保持中立，不对所包含内容的准确性、可靠性或完整性提供任何明示或暗示的保证。请读者仅作参考，并请自行承担全部责任。