摘要：通过确定Na2S2O4对EA.hy926细胞造成缺氧损伤的最佳浓度和时间点建立缺氧损伤模型，以只加Na2S2O4为对照组，添加不同浓度的苞叶雪莲（Saussureaobvallata）粗提物，从细胞形态和细胞生存率两个方面检测其抗缺氧作用，分析苞叶雪莲粗提物对Na2S2O4造成EA.hy926细胞缺氧损伤的保护作用。结果表明，苞叶雪莲粗提物从1.25mg/mL浓度开始呈剂量依赖性的增加了缺氧模型组中EA.hy926细胞的相对存活率，在10mg/mL浓度下与Na2S2O4模型组相比，极显著增加了细胞存活率，是缺氧模型组的6.3倍，表明苞叶雪莲具有很强的抗缺氧损伤能力。
　　关键词：苞叶雪莲（Saussureaobvallata）；EA.hy926细胞；缺氧损伤
　　高原环境因其海拔原因具有气压低、氧气稀薄、空气干燥、气候寒冷、紫外线照射强烈等一系列恶劣条件，并随着海拔的升高这些条件进一步恶化，为高原地区人们的生活、工作及身体健康造成负面影响。目前，国内外学者普遍认为，长期暴露在缺氧环境中会对人的认知功能产生一些影响，如感知觉、记忆力、思维力和注意力的下降等，并且对情绪情感和心理运动能力都有负面反应[1]。苞叶雪莲（Saussureaobvallata）是菊科风毛菊属的植物。分布在印度、锡金、尼泊尔、克什米尔以及中国大陆的云南、甘肃、四川、西藏、青海等地，生长于海拔3200～4700m的地区，在藏药中用于治疗癫狂、中风、脑溢血和偏瘫等神经性疾病[2]，现在学者认为苞叶雪莲水提物对小鼠的免疫系统和生殖系统及整体水平具有辐射防护作用[3-5]。本试验通过确定连二硫酸钠（Na2S2O4）对EA.hy926细胞造成缺氧损伤的最佳浓度和时间点建立缺氧损伤模型，以只加Na2S2O4为对照组，添加不同浓度的苞叶雪莲粗提物，从细胞形态和细胞生存率两个方面检测其抗缺氧作用，探讨苞叶雪莲粗提物是否具有对Na2S2O4造成EA.hy926细胞缺氧损伤的保护作用，为进一步细分该药中抗缺氧具体成分奠定基础和参考依据。
　　1材料与方法
　　1.1细胞株
　　EA.hy926细胞株购于中国科学院上海细胞库。
　　1.2药材与试剂
　　苞叶雪莲粗提物：苞叶雪莲于2013年8月采自青海省贵德县，经青海省食品药品检验所藏药室骆桂法研究员鉴定，为菊科风毛菊属苞叶雪莲全草。将采集的苞叶雪莲研磨成粗粉经90%乙醇热回流提取，提取液浓缩至流浸膏（相当于10g/mL生药），使用时用生理盐水稀释；连二亚硫酸钠（Na2S2O4）、三氯乙酸（TCA），国药集团化学试剂有限公司；培养基（DMEM）、96孔板、培养瓶，Corning公司；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶[0.25%Trypsin-EDTA（1×）]，Gibco公司；二甲基亚砜、磺酰罗丹明B（SRB），Sigma公司。
　　1.3试验方法
　　1.3.1细胞的培养复苏EA.hy926细胞，置于37℃，5%CO2湿度饱和的培养箱中，用含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基培养，0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化，在细胞处于对数生长期时进行试验。
　　1.3.2缺氧模型的建立将EA.hy926细胞10000～20000/孔接种于96孔板中，检测Na2S2O4造成细胞缺氧状态的最佳浓度，Na2S2O4可以很快清除缓冲液里的氧，使溶液氧含量为零。Na2S2O4用生理盐水配制成100mmol/L母液，参考文献[6-9]以终浓度8mmol/L为首浓度，2倍稀释，共做7个浓度，作用24h。IncuCyte镜下观察细胞形态，用SRB法计算不同浓度的Na2S2O4对EA.hy926细胞的抑制率及半数抑制浓度IC50。首先，弃去培养基，每孔加100μL浓度为30%的预冷TCA，置于4℃1h固定细胞，用去离子水洗涤5次后，晾干，之后每孔加入100μL浓度为0.04mg/mL磺酰罗丹明B（SRB，1%冰醋酸配制）染色15min，染色结束后用1%冰醋酸洗涤5次，去除未与细胞结合的SRB，晾干，最后每孔用10mmol/L的Tris-base溶液150μL溶解染料，置于摇床上至染料完全溶解均匀后，用酶标仪在560nm波长下读取OD560nm，抑制率=（对照组OD560nm-给药组OD560nm）/对照组OD560nm×100%。IC50通过四参数曲线拟合法计算。通过以上结果选定最佳破坏剂量和时间，拍照记录，选定模型浓度，用以进行后续试验。
　　1.3.3细胞分组及检测检测苞叶雪莲粗提物对缺氧状态下细胞的保护作用，将EA.hy926细胞10000～20000/孔接种于96孔板中，细胞分为三组，阴性对照组、缺氧模型组和加药组。加药组加入苞叶雪莲粗提物，以10mg/mL为首浓度，2倍稀释，共8个浓度，粗提物用二甲基亚砜（DMSO）溶解后用生理盐水稀释成试验所需浓度，加药后确保DMSO终浓度<0.1%，加入96孔板中预孵育2h后，加入8mmol/L的Na2S2O4建立细胞缺氧模型，作用24h。IncuCyte镜下观察细胞形态学变化并拍照记录。达到最佳破坏时间后用SRB法检测细胞的相对存活率，相对存活率=给药组或缺氧模型组OD560nm/阴性对照组OD560nm×100%。

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