高效液相色谱法测定连花清瘟颗粒中连翘酯苷A含量(2)
2.3线性关系考察
精密吸取对照品溶液1、4、10、12、14μL分别进样测定,记录色谱图,以对照品的峰面积为纵坐标,对照品量(μg)为横坐标进行线性回归,连翘酯苷A回归方程为Y=1240X+16.82,r=0.9999,表明连翘酯苷A在0.1~1.4μg范围内线性关系良好。
2.4精密度试验
取上述已制备的供试品溶液,连续进样6次,记率录色谱图,结果计算得连翘酯苷A峰面积RSD=0.82%,表明仪器精密度良好。
2.5稳定性试验
取本品颗粒剂,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,分别于第0、1、2、4、8、12、24h进行测定,每次进样10μL,结果供试品中连翘酯苷A含量的RSD=0.85%,表明该方法制备的供试品溶液在24h内含量基本不变。
2.6重复性试验
选择同一批号样品,按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液,分别进样,测定峰面积。结果供试品中连翘酯苷A含量RSD=1.88%,重复性良好。
2.7加样回收率试验
取已知含量的连花清瘟颗粒,按1∶1比例分别添加连翘酯苷A对照品,按“2.2”项下色谱条件,分别进样,记录色谱图,测定,结果表明平均回收率为101.53%,RSD=1.71%,见表1。
2.8空白试验
取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液,进样10μL,结果连花清瘟颗粒的阴性对照溶液,在连翘酯苷A处未出现相同保留时间的色谱峰,表明无干扰,此方法可行。色谱图见图1。
2.9样品测定
取连花清瘟颗粒3批,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,按上述色谱条件,平行测定3次,采用外标法计算含量,结果见表2。
3讨论
本试验主要参考2010年版《中华人民共和国药典》(一部)中连翘药材中连翘酯苷A测定条件测定连花清瘟颗粒中连翘酯苷A含量,流动相为乙腈-0.4%冰醋酸(15∶85),同时对流动相比例乙腈-0.4%冰醋酸(17∶83)及乙腈-0.4%冰醋酸(20∶80)进行了研究,结果均不理想,故仍选用乙腈-0.4%冰醋酸(15∶85)为流动相。
根据文献[5]确定采用甲醇后分别对60%、70%、80%不同浓度的溶剂进行试验,结果表明70%甲醇制备的样品测得含量较高,故选用70%甲醇作为提取溶剂。本研究分别对15、20、25mL溶剂用量进行试验,结果表明,25mL甲醇制备的样品测得含量较高,故选择加入25mL甲醇。确定以上条件后,分别对冷浸、超声处理、回流3种不同提取方法进行试验,结果表明,超声处理及回流方法测得样品含量接近,冷浸略低,故选用超声处理作为提取方法。然后分别对超声处理20、30、40min进行试验,结果表明,超声处理20min略低,30、40min测得样品含量接近,故选用超声处理30min。
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