1.1  材料

　　1.1.1  菌株来源  大连黑石礁沿海海域自然生长的石花菜。分离培养基（2216E）：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，磷酸高铁0.01 g，琼脂20 g，陈海水1 000 mL，pH 7.2～7.8，121 ℃，20 min 灭菌后倒平板。种子培养基：琼脂1 g，其他成分同分离培养基。发酵培养基：同种子培养基。

　　1.1.2  主要试剂及仪器  琼脂及其他化学试剂均来自北京奥博星生物技术有限责任公司。JSM-460LV型扫描电镜（英国牛津仪器公司），722型光栅分光光度计（上海分析仪器厂）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  产琼胶酶海洋细菌的分离  将采集的50份石花菜样品用剪刀将其剪成细小碎片，置于含有玻璃珠的海水中振荡30 min，取不同稀释梯度的菌悬液涂布在分离培养基，28 ℃培养观察。以能产生琼脂凹陷圈为标准，挑取凹陷圈较大的菌株，单菌落斜面保藏以筛选产琼胶酶性能优良菌株。

　　1.2.2  产琼胶酶性能优良菌株的筛选  挑取筛选菌株一环，接入装有5 mL种子培养基的大试管中， 28 ℃，150 r/min摇床培养24 h后，转接到装有30 mL/100 mL发酵培养基的三角瓶中，28 ℃，150 r/min摇床培养48 h，取培养液于8 000 r/min离心5 min后，上清液以DNS法（3， 5 - 二硝基水杨酸法）[9]测量琼胶酶活力。DNS法琼胶酶活力测定方法：取1 mL发酵上清液和1 mL磷酸缓冲液（琼脂0.2 g/L，pH 7.0）于试管内，于40 ℃温浴30 min后加入2mL DNS试剂，混合液在沸水中水浴10 min后用去离子水定容至25 mL，充分混匀后在540 nm处测量吸光度值。酶活力定义：以煮沸灭活的上清液为空白对照，以1 mL酶液1 min产1 μg还原糖定义为1个活力单位。

　　1.2.3  产琼胶酶海洋细菌的电镜形态观察  电子扫描电镜观察细胞形态。

　　1.2.4  产琼胶酶海洋细菌鉴定  菌株的形态学和生理生化特性的测定： 根据《常见细菌系统鉴定手册》所列菌种鉴定的方法进行菌种的鉴定[10]。菌株的16S rRNA基因序列测定和分析： ① 16S rRNA基因序列测定：由宝生物工程有限公司完成。②16S rRNA基因序列结果分析：将所得到的基因序列利用BLAST软件与GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库进行序列比对， 获取相近典型菌株的16S rRNA基因序列， 采用ClustalX和MEGA软件包进行分析， 用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树， 进行系统发育分析， 各枝上的数字是1 000次Bootstrap重抽样分析的支持百分比[11-13]。

　　2  结果

　　2.1  细菌分离结果

　　从50份石花菜样本中分离得到83株菌株，根据琼脂凹陷圈大小得到具有较明显分解琼脂能力的菌株30株（图1A），经卢哥氏碘液染色后产生透明圈（图1B）。

　　2.2  高产琼胶酶菌株的筛选

　　以初步分离得到的30株菌株为出发菌株，测得其48 h琼胶酶活力（表1）。其中酶活力平均值在10以上的菌株有15株，酶活力最高菌株为ZGR-26菌株，达到32.1。由于这些菌株的菌落形态较为相似，认为是同一种菌，所以选取产酶活力最高的ZGR-26菌株进行鉴定。

　　2.3  产琼胶酶菌株ZGR-26的形态、培养特征及理化特性

　　琼胶酶产生菌ZGR-26在2216E固体培养基培养48 h后观察， 菌落呈扁圆形凸起， 光滑， 比较湿润， 白色或淡黄色，透明，边缘整齐， 无可溶性色素， 周边分解琼脂产生透明凹陷。电镜观察， 细胞短杆状，（1.0～1.5） μm×（1.5～2.0） μm， 无芽孢， 革兰氏染色阴性（图2）。

　　ZGR-26的部分生理生化特征见表2。将该菌株与V. agarivorans进行生理生化特征鉴定比较， 结果表明菌株ZGR-26所测定的生理生化反应与V. agarivorans作为属间种的鉴别的特征基本相符（但是ZGR-26能利用蔗糖作为碳源，而V. agarivoran则不能），由此初步鉴定该菌为食琼胶弧菌。

　　2.4  16S rRNA基因序列分析

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