1.5Westernblot分析检测Ⅰ型前胶原蛋白的表达

　　胰酶消化收集心脏成纤维细胞于离心管中，离心后加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂RIPA，离心后用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量，分装上清用于加样。配制9%的分离胶及4%的浓缩胶，将总蛋白加至上样孔中，进行SDS-PAGE恒压电泳，染色转膜后，杂交、显色，用封闭液将一抗稀释（抗Ⅰ型前胶原1∶500）。包被一抗、二抗，膜用TBST液洗3次，每次5min，采用ECL发光试剂盒显色。膜洗涤完毕置于保鲜膜上，滴加底物工作液后用保鲜膜包好，放入暗室。在暗室中将X光片小心地压到保鲜膜上，依顺序进行曝光、显影、定影。采用凝胶图像分析系统对吸光度进行测量。

　　1.6统计学方法

　　采用统计软件SPSS13.0对实验数据进行分析，正态分布计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Student-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1不同浓度罗格列酮对高糖诱导的心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA及蛋白表达的影响

　　基础生理状态下，体外培养的心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白呈低表达，HG模型组Ⅰ型前胶原mRNA[（109±11）%]和蛋白（1.57±0.02）的表达与空白对照组[（40±3）%、（0.82±0.04）]比较显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。浓度依赖性实验结果显示，HG+10μmol/LRos组Ⅰ型前胶原mRNA[（91±9）%]和蛋白（1.35±0.03）的表达低于HG模型组[（109±11）%、（1.57±0.02）]；HG+30μmol/LRos组Ⅰ型前胶原mRNA[（62±5）%]和蛋白（1.08±0.04）的表达低于HG+10μmol/LRos组[（91±9）%、（1.35±0.03）]；HG+50μmol/LRos组Ⅰ型前胶原mRNA[（51±4）%]和蛋白（0.93±0.02）的表达低于HG+30μmol/LRos组[（62±5）%、（1.08±0.04）]，差异均有统计学意义（P<0.05）。以上结果显示，Ros呈明显的浓度依赖性的下调Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白的表达。见表1、2及图1。

　　2.2罗格列酮（30μmol/L）不同干预时间对Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白表达的影响

　　30mmol/L的HG孵育心肌成纤维细胞6h后，以含0.1%胎牛血清DMEM培养基继续培养24h，再加入30μmol/L的Ros分别干预18、24、36h，结果显示，HG+30μmol/LRos18h组Ⅰ型前胶原mRNA[（91±10）%]和蛋白（1.31±0.07）的表达低于HG模型组[（109±11）%、（1.57±0.02）]；HG+30μmol/LRos24h组Ⅰ型前胶原mRNA[（67±6）%]和蛋白（1.01±0.04）的表达低于HG+30μmol/LRos18h组[（91±10）%、（1.31±0.07）]；HG+30μmol/LRos36h组Ⅰ型前胶原mRNA[（42±4）%]和蛋白（0.87±0.01）的表达低于HG+30μmol/LRos24h组[（67±6）%、（1.01±0.04）]，差异均有统计学意义（P<0.05）。以上结果显示，相同浓度Ros呈明显的时间依赖性下调Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白的表达。见表3及图2。

　　3讨论

　　糖尿病合并心肌病患者的心肌损害包括心肌细胞及心肌间质细胞两个方面。已有的研究主要集中于心肌细胞的损伤，近年来，心肌间质的纤维化及其在糖尿病心肌病的发生、发展中的作用越来越多地受到研究者的重视。糖尿病患者的心肌纤维化进展到一定程度后会导致心室的收缩、舒张功能失调，加速心功能恶化，当心功能出现失代偿时便会出现心力衰竭症状。因此预防和减轻心肌间质胶原沉积及纤维化已成为糖尿病心肌病治疗的重要目标和手段。既往的研究显示，高血糖可导致心肌间质胶原蛋白沉积，从而导致纤维化。高血糖导致胶原大量沉积的机制为高浓度的葡萄糖一方面可促使胶原蛋白的糖基化，另一方面可降低胶原蛋白的降解，引起胶原沉积与心内膜下，导致心肌的纤维化及重构；另外，高血糖会激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）可上调致纤维化的细胞因子的表达[5]，激活PKC信号系统的关键信号蛋白--成纤维细胞生长因子（FGF）的表达[6]，而且高血糖可使转化生长因子-β（TGF-β）异常高表达，后者与其受体Ⅱ结合后可以诱导组织型基质金属蛋白酶抑制剂合成，抑制细胞外基质（ECM）的降解[7]，加重心肌纤维化程度。

期刊库（http://www.zgqkk.com），是一个专门从事期刊推广、投稿辅导的网站。
　　本站提供如何投稿辅导，寻求投稿辅导合作，快速投稿辅导，投稿辅导格式指导等解决方案：省级投稿辅导/国家级投稿辅导/核心期刊投稿辅导//职称投稿辅导。

　　【免责声明】本文仅代表作者本人观点，与投稿辅导_期刊发表_中国期刊库专业期刊网站无关。投稿辅导_期刊发表_中国期刊库专业期刊网站站对文中陈述、观点判断保持中立，不对所包含内容的准确性、可靠性或完整性提供任何明示或暗示的保证。请读者仅作参考，并请自行承担全部责任。