1.2.4 黏附作用的测定 采用Hattori等[2-7]的研究方法测定其对变形链球菌的黏附抑制作用。取84个10 mL玻璃试管，设每组4个平行管，分别加入以上备好的菌液0.1 mL，BHI液体培养基2.1 mL和50%蔗糖-0.5 mol/L磷酸盐缓冲液0.25 mL，再分别向各个试管中加入实验组（分别为含不同分子量不同浓度的羧甲基壳聚糖的BHI培养基3 mL）和对照组（不含羧甲基壳聚糖溶液）溶液0.05 mL，混和均匀，将各个试管与水平面斜行呈300°角放置，37℃（80%N2、10%H2、10%CO2）的条件下放置于厌氧箱中培养18 h。然后轻轻移去试管中的溶液，将黏附到试管壁的细菌用蒸馏水洗脱，每次3 mL，共计3次，然后以3500 r/min离心15 min（离心半径13.5 cm），收集细菌，再将其置于3 mL蒸馏水中，混匀。用波长为550 nm的紫外可见分光光度计测定A550nm，计算黏附抑制率。羧甲基壳聚糖对变形链球菌的黏附抑制的影响使用黏附抑制率表示。黏附抑制率=（对照组A550nm-实验组A550nm）/对照组A550nm×100%

　　1.3 统计学方法

　　采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，各样本组间均数之间的比较采用SNK检验。以P <0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 羧甲基壳聚糖对变形链球菌ATCC 25175表面疏水性的影响

　　结果见表1，不同分子质量羧甲基壳聚糖随着其浓度的增加其疏水率逐渐降低。经统计学分析：同一分子质量，浓度不同各组羧甲基壳聚糖与对照组之间差异均有统计学意义（P < 0.05）。组间两两比较结果显示：分子量为5500的羧甲基壳聚糖浓度为1.25、2.5、5.0 g/L组间差异有统计学意义（P < 0.05）；0.64、0.32、0.16 g/L时，组间差异无统计学意义（P > 0.05）；分子量为10 000的羧甲基壳聚糖浓度为0.64、1.25、2.5、5.0 g/L组间差异有统计学意义（P < 0.05）；0.32 g/L与0.16 g/L时组间差异无统计学意义（P > 0.05）；分子量为12 000的羧甲基壳聚糖，5 g/L与2.5 g/L，0.64 g/L、0.32 g/L、0.16 g/L之间组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。

　　2.2 羧甲基壳聚糖对变形链球菌培养后菌液吸光度值的影响

　　结果见表2，随着羧甲基壳聚糖溶液浓度的升高，其黏附吸光度值逐渐降低。经统计学检验，分子质量相同，浓度不同的各实验组与对照组之间差异均有统计学意义（P < 0.05）。组间两两比较结果显示：当分子量为5500及10 000时，0.32 g/L与0.16g/L两浓度组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）；当分子量为12 000时，0.64、0.32、0.16 g/L浓度组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。

　　2.3 羧甲基壳聚糖对变形链球菌黏附抑制的影响

　　结果见表3，不同分子质量羧甲基壳聚糖随着其浓度的增加其黏附抑制率也随之降低。经统计学分析，分子质量相同，浓度不同的各组黏附抑制值总体均数间具有显著性差异（P < 0.05）。两两比较结果显示：分子质量为5500及10 000时，0.32 g/L与0.16 g/L两个浓度组间比较无统计学差异。分子量为12000时，0.64 g/L、0.32 g/L与0.16 g/L浓度组间比较无统计学差异（P > 0.05），其他各浓度组间黏附抑制值均有显著性差异（P < 0.05）。

　　3 讨论

　　3.1 壳聚糖/羧甲基壳聚糖对变形链球菌的疏水性作用的影响

　　目前研究认为，蔗糖非依赖性黏附主要是通过疏水作用、钙桥静电、氢键等非特异性黏附和细菌表面粘结素与获得性膜受体之间的特异性黏附。疏水性是指非极性溶液在极性水中所呈现的一种不稳定状态，并由此引发的一系列热能和分子重新分布及排列的变化[8]。CSH被认为是影响细菌一宿主反应的因素之一，其强弱与蔗糖非依赖性黏附密切相关[9]。近期的研究发现，疏水性的强弱与细菌表面蛋白、菌毛、脂磷壁酸、荚膜等结构有关。细菌表面的疏水蛋白与获得性膜中的疏水基团结合，表面疏水蛋白愈多其疏水性愈强，细菌黏附力也愈强[10]。

　　MATH是根据细菌在各种碳氢化合物中经过简短期的混合，下层水相吸收能力减少，从而导致细菌对碳氢化合物黏附的程度不同，通过测定水相的吸光度，可确定细菌表面疏水性的大小[11]。本实验即采用该方法研究羧甲基壳聚糖对变形链球菌疏水性的影响。结果表明：不同分子量的羧甲基壳聚糖溶液，浓度为0.16 g/L时作用于变形链球菌细胞表面，其表面疏水性明显降低，与空白对照组之间有显著性差异。本实验表明：浓度为0.16 g/L羧甲基壳聚糖溶液可以通过表面疏水性明显降低来抑制变形链球菌的黏附作用。它的作用机制是疏水作用、钙桥静电、氢键等非特异性黏附和细菌表面粘结素与获得性膜受体之间的特异性黏附，还是通过其他方式，需要进一步进行机制的研究。

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