[摘要]目的研究大蒜素对耐紫杉醇人肺腺癌A549/Taxol细胞增殖及凋亡的影响。方法采用CCK8法检测不同浓度大蒜素及大蒜素与紫杉醇联合应用后对A549/Taxol细胞增殖抑制率及紫杉醇IC50值。ELISA法测定细胞上清液缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）与血管内皮生长因子（VEGF）水平，比色法检测caspase-3、caspase-8活性变化。结果大蒜素对A549/Taxol细胞增殖有明显抑制作用（P<0.05），两药联合后紫杉醇IC50由861.61μg/ml下降至149.02μg/ml；随大蒜素浓度增加，A549/Taxol细胞上清液HIF-1α与VEGF水平呈下降趋势，caspase-8、caspase-3蛋白活化增加。结论大蒜素能显著抑制A549/Taxol细胞增殖、诱导其凋亡，可能与HIF-1α及VEGF表达下降及caspase-8、caspase-3激活相关。

　　[关键词]大蒜素；A549/Taxol细胞；耐药；紫杉醇

　　[中图分类号]R734.2[文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2013）09（c）-0013-03

　　肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其5年生存率仅为13%～16%[1]。紫杉醇是肺癌治疗的一线化疗药物。但肺癌细胞对紫杉醇耐药常导致治疗失败。研究证实，大蒜素对肺癌等多种肿瘤均有显著的抗癌作用[2-3]，但其对耐药细胞影响的研究甚少。本文旨在观察大蒜素对体外培养耐紫杉醇细胞株A549/Taxol的生长抑制作用并探讨其作用机制。

　　1材料与方法

　　1.1试剂及材料

　　大蒜素注射液为上海禾丰制药有限公司产品（批号为121208）；紫杉醇注射液为扬子江药业产品（批号为110910）；CellCountingKit-8购自日本同仁化学研究所；HIF-1α与VEGFELISA检测试剂盒购自南京凯基生物公司；caspase-3、caspase-8活性检测试剂盒购自碧云天生物公司。

　　1.2细胞培养

　　A549/Taxol细胞由南京凯基生物公司提供，用含10%小牛血清及100μg/ml紫杉醇的RPMI1640培养液于37℃，5%二氧化碳及饱和湿度的培养箱培养，胰酶消化法传代培养，每周2～3次。

　　1.3CCK8法分别检测大蒜素及紫杉醇对A549/Taxol细胞增殖的影响

　　取对数生长期A549/Taxol细胞，调整细胞密度1.0×105个/ml，取100μl接种于96孔板培养，细胞进入对数生长期后依次加入大蒜素终浓度为0、20、40、60、80μg/ml的RPMI1640培养基100μl；同法配置紫杉醇，终浓度分别为0、10、100、1000、2000μg/ml，每组设5个复孔，孵育72h，每孔加入CCK8检测液10μl，酶标仪测定450nm波长各孔OD值，计算细胞抑制率及IC50值。抑制率=（1-加药组A值/对照组A值）×100%。

　　1.4两药联合应用对紫杉醇IC50值的影响

　　根据1.3实验结果，向96孔板培养的A549/Taxol细胞中加入IC50值的大蒜素作用24h后，更换终浓度分别为0、10、100、1000、2000μg/ml的紫杉醇溶液，培养72h，观察两药联合培养后A549/Taxol细胞紫杉醇IC50变化。

　　1.5ELISA检测细胞上清液HIF-1α与VEGF含量

　　取对数生长期A549/Taxol细胞，调整细胞密度2.0×104个/ml，取3ml接种于24孔培养板，细胞进入对数生长期，依次加入大蒜素终浓度为0、40、80μg/ml的RPMI1640培养，孵育72h后收集细胞上清液，BCA法检测蛋白浓度，根据ELISA试剂盒说明分别测定缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）与血管内皮生长因子（VEGF）蛋白浓度。

　　1.6比色法检测caspase-3、caspase-8活性

　　取对数生长期A549/Taxol细胞，调整细胞密度1.0×105个/ml，取5ml接种于6孔培养板，细胞进入对数生长期，依次加入大蒜素终浓度为0、40、80μg/ml的RPMI1640培养，孵育72h后收集细胞并提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，取30μg蛋白分别加入caspase-3、caspase-8检测液，每组设，4个复孔，37℃孵育1.5h，酶标仪检测405nm波长各孔OD值，依据标准曲线计算caspase-3、caspase-8活性单位。

　　1.7统计学分析

　　采用SPSS16.0统计学软件进行数据分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1大蒜素及紫杉醇对A549/Taxol细胞增殖能力的影响

　　实验结果显示大蒜素对A549/Taxol细胞增殖有显著的抑制作用，随大蒜素浓度增加，A549/Taxol细胞增殖显著下降，72h大蒜素IC50为51.83μg/ml。低剂量紫杉醇对A549/Taxol细胞无明显抑制作用，大剂量紫杉醇能抑制A549/Taxol细胞生长，72h紫杉醇IC50为861.610μg/ml。当两药联合时，A549/Taxol细胞生长显著减慢，紫杉醇IC50下降至149.02μg/ml（图1）。

　　2.2大蒜素对A549/Taxol细胞上清液HIF-1α与VEGF含量的影响

　　以终浓度为0、40、80μg/ml的大蒜素作用于A549/Taxol细胞72h后，各组HIF-1α蛋白含量分别为（0.32±0.02）、（0.18±0.02）、（0.05±0.01）ng/ml；VEGF蛋白含量分别为（0.88±0.04）、（0.58±0.06）、（0.20±0.01）ng/ml；随大蒜素浓度增加，HIF-1α与VEGF含量均明显降低（P<0.05）（图2）。

　　2.3大蒜素对A549/Taxol细胞caspase-3、caspase-8活性影响

　　大蒜素能显著激活A549/Taxol细胞caspase-3、caspase-8蛋白。随大蒜素浓度增加，caspase-3、caspase-8蛋白活性单位呈显著增强（P<0.05）（表1）。

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