[摘要]目的初步探索不同时间的缺血预处理对兔肝细胞深低温保存的影响。方法体重2～2.5kg的3月龄纯种新西兰大白兔40只，根据分离前是否采用缺血预处理及预处理时间，分为未预处理组（NPC组），5min缺血预处理组（IPC5组），10min缺血预处理组（IPC10组），15min缺血预处理组（IPC15组），每组各10只。采用胶原酶离体两步灌流法分离肝细胞。于2、3、4周分别提取各组肝细胞样本，进行存活率、谷丙转氨酶（ALT）的检测。结果冻存前，各组新鲜分离的肝细胞平均存活率差异无统计学意义（P=0.69>0.05）。冻存后：①2、3、4周时检测各组样本存活率和谷丙转氨酶（ALT），差异均有统计学意义（均P<0.05）。两两比较结果显示，2、3、4周时IPC5组和IPC10组细胞存活率及ALT差异无统计学意义（P>0.05）；且各时段IPC5组和IPC10组细胞存活率最高，ALT最低，而IPC15组细胞存活率最低，ALT最高。②同组内不同时间，细胞存活率、ALT检测差异均无统计学意义（P>0.05）。结论合适时间的缺血预处理可以提高兔肝细胞深低温保存的效果。

　　[关键词]缺血预处理；兔肝细胞；深低温保存

　　近几十年来，肝细胞的实验和临床应用研究已经取得了卓越成就，尤其是在生物人工肝和肝细胞移植等方面，为肝脏疾病的治疗展现了诱人的前景[1-6]。随着对肝细胞需求的不断增加，寻找可以长期有效保存肝细胞的方法就迫在眉睫。此外，目前已有的研究表明合适的肝脏缺血预处理（ischemicpreconditioning，IPC）可以为肝脏缺血再灌注损伤提供有效的保护[7-19]。该实验正是利用缺血预处理对肝脏产生的这种保护机制，通过对不同时间缺血预处理的兔肝细胞存活率及功能情况的检测，探讨对兔肝脏进行适当时间的缺血预处理是否可以提高分离后肝细胞低温保存的效果，从而推动其在临床实践中的应用。

　　1材料与方法

　　1.1实验材料

　　1.1.1实验动物与分组军事医学科学院实验动物中心提供纯种雄性新西兰大白兔40只，3月龄，体重2～2.5kg，随机分为4组：未预处理组（NPC），5min缺血预处理组（IPC5），10min缺血预处理组（IPC10），15min缺血预处理组（IPC15）。

　　1.1.2主要试剂仪器电热恒温水浴箱为上海医用恒温设备厂生产，高速低温台式离心机为德国Eppendorf公司生产，4℃冰箱及-20℃冰箱为中国海尔生产，-80℃冰箱为日本SANYO生产，BeckmanSYNCHRONCX4CE型全自动生化分析仪为美国Beckman公司生产，Ⅳ型胶原酶、Hanks液、D-hanks液和台盼蓝购于美国Sigma公司，RPMI-1640培养液和胎牛血清购于美国Hyclone公司，二甲基亚砜（DMSO）购于德国Appliche公司。

　　1.2试验方法

　　1.2.1缺血预处理术前禁食12h，20%乌拉坦以5mL/kg耳缘静脉注射麻醉动物，腹部皮肤褪毛，常规消毒铺巾，腹正中切口进入腹腔，暴露并游离肝脏，分离出下腔静脉、门静脉和肝动脉，NPC组不行特殊处理；IPC5组为无损伤血管夹夹闭肝血供5min，再复流5min；IPC10组为无损伤血管夹夹闭肝血供10min，再复流10min；IPC15组为无损伤血管夹夹闭肝血供15min，再复流15min。

　　1.2.2分离肝细胞采用改良Seglen二步胶原酶灌注法分离肝细胞[20]，收集的肝细胞，加入含20%胎牛血清的PRMI-1640液制成悬液，细胞浓度为4×105/mL。

　　1.2.3肝细胞的低温保存将新制备的细胞悬液移入冻存液（为含15%DMSO、20%胎牛血清的PRMI1640培养液）中，终浓度配制成4×106/mL，然后移入2mL的冻存管中，各组分别制备30个样本。将样本放置4℃冰箱中30min→-20℃冰箱中放置1h→-80℃冰箱中放置4h→然后快速放于-196℃液氮中保存。

　　1.2.4复苏各组分别于2、3、4周后取出样本10个，立即置于37℃水浴箱内解冻复苏。1000r/min离心5min，离心3次，弃去上清液，加入RPMI1640培养液，重新混悬，浓度为4×105/mL。

　　1.2.5指标检测将上述冻存前及复苏后的肝细胞悬液分别取样，用锥虫蓝拒染法测定细胞存活率。将各组肝细胞于复温后各时段分别取样进行培养，并于培养24h后分别取细胞上清液，检测谷丙转氨酶（ALT）。

　　1.3统计学方法

　　采用统计软件SPSS13.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1各组冻存前肝细胞存活率比较

　　各组分离肝细胞经过锥虫蓝拒染法检测，肝细胞存活率差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

　　2.2各组不同时段冷冻复温后肝细胞存活率比较

　　用锥虫蓝拒染法测定各时段冷冻复温后肝细胞存活率结果为：①2周时各组比较差异有统计学意义（P=0.00<0.05）。两两比较后发现，IPC5组与IPC10组比较差异无统计学意义（P=0.51>0.05），IPC5组≈IPC10组>NPC组>IPC15组。②3周时各组比较差异有统计学意义（P=0.00<0.05）。两两比较后发现，IPC5组与IPC10组比较差异无统计学意义（P=0.08>0.05），IPC5组≈IPC10组>NPC组>IPC15组。③4周时各组比较差异有统计学意义（P=0.00<0.05）。两两比较后发现，IPC5组与IPC10组比较差异无统计学意义（P=0.16>0.05），IPC5组≈IPC10组>NPC组>IPC15组。此外，还可发现同组不同时段复苏的肝细胞存活率差异均无统计学意义（P=0.17、0.20、0.17、0.50）。见表2。

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