1.6四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞生长抑制率

　　取1×104AsPC-1细胞接种于96孔培养板，同上述方法进行基因转染24h后，分别加入不同浓度（2、5、10μmol/L）的GEM，将实验进行如下分组：①未加药+无转染组（空白组）；②加药+无转染组（对照组）；③加药+转染空载体组（空载体组）；④加药+转染N1/Plk-1组（实验组）；每组设3个复孔，继续作用24h，每孔加入20μLMTT（5mg/mL）继续培养6h，吸弃去培养液，加入150μLDMSO，酶标仪测定490nm处吸光度（A）值。根据3孔平均A值计算细胞生长抑制率（%）=（1-A实验组/A空白组）×100%。即处理组细胞抑制率（%）=（1-A处理组/A空白组）×100%；对照组细胞抑制率（%）=（1-A对照组/A空白组）×100%。

　　1.7流式细胞仪进行细胞凋亡分析

　　鉴定转染成功后，将实验进行如下分组：①未加药+无转染组；②未加药+转染空载体组；③未加药+转染N1/Plk-1组；④GEM+无转染组；⑤GEM+转染空载体组；⑥GEM+转染N1/Plk-1组，每组设3个复孔，5%CO2，37℃培养24h后，参照体内血药峰值浓度分别加入5μmol/LGEM，继续培养24h，胰酶消化收集细胞，1×106个细胞加入1mLDNA低渗缓冲碘化丙啶（PI）染液（0.1%柠檬酸三钠、50μg/mLPI、100μg/mLRnase），4℃避光作用30min，流式细胞仪检测DNA含量，凋亡细胞表现为亚二倍体凋亡峰。

　　1.8统计学方法

　　采用统计软件SPSS10.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1Plk-1基因cDNA的克隆

　　琼脂糖凝胶电泳证实在AsPC-1细胞中成功地扩增了全长为450bp大小的Plk-1基因。见图1。

　　1：分子量标准；2：全长Plk-1基因

　　图1Plk-1基因cDNA的RT-PCR结果

　　2.2Plk-1真核表达载体的鉴定

　　RT-PCR结果证实挑取克隆酶切鉴定正确（泳道3）后测序结果与Genbank原序列对比结果一致，由此证明成功地构建了450bpPlk-1真核表达载体pcDNA3.1/Plk-1。见图2。

　　1：分子量标准；2：pcDNA3.1/HindⅢ+BamH；

　　3：pcDNA3.1/Plk-1/HindⅢ+BamH

　　图2pcDNA3.1/Plk-1真核表达载体HindⅢ

　　和BamHⅠ酶切鉴定结果

　　2.3目的基因表达的RT-PCR鉴定

　　以β-actin作为内对照，分别比较未转染组AsPC-1细胞组、转染空载体pcDNA3.1组及pcDNA3.1/Plk-1组24h各组细胞内Plk-1基因的mRNA水平，Plk-1mRNA相对量分别为（2.14±0.16）、（2.18±0.15）、（2.58±0.18），在数值上，转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比，差异有高度统计学意义（P<0.01）（图3）。说明转染Plk-1基因的AsPC-1/Plk-1细胞组中Plk-1基因在mRNA水平表达水平明显升高。

　　M：分子量标准；1：AsPC-1细胞；2：AsPC-1/pcDNA3.1细胞；

　　3：AsPC-1/Plk-1细胞

　　图3RT-PCR鉴定各组细胞内Plk-1基因mRNA水平

　　2.4Westernblot鉴定细胞内Plk-1蛋白的表达

　　以β-actin作为内对照，比较分别AsPC-1正常细胞组、转染空载体pcDNA3.1组及pcDNA3.1/Plk-1组24h各组细胞内Plk-1蛋白的表达水平分别为（0.989±0.018）、（1.022±0.021）、（1.243±0.143），shPlk-1转染组Plk-1蛋白相对量相对较低，其中以shPlk-1-3转染组显著低于其它各组，差异有高度统计学意义（P<0.01）。转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比，差异有高度统计学意义（P<0.01）（图4）。说明转染Plk-1基因的AsPC-1/Plk-1细胞组中Plk-1蛋白表达水平明显升高。

　　1：分子量标准；2：AsPC-1细胞；3：AsPC-1/pcDNA3.1细胞；

　　4：AsPC-1/Plk-1细胞

　　图4Westernblot鉴定各组细胞内Plk-1蛋白表达

　　2.5MTT法检测细胞生长抑制率

　　由图5可以看出，不同浓度GEM作用后，转染48hpcDNA3.1/Plk-1后的AsPC-1/Plk-1细胞生长抑制率明显高于空白AsPC-1细胞及转染空载体pcDNA3.1的AsPC-1/pcDNA3.1细胞，说明过表达Plk-1基因可以降低GEM对胰腺癌AsPC-1细胞的生长抑制作用。见表1、图5。

　　2.6胞浆过表达Plk-1抑制化疗药物诱导的AsPC-1细胞凋亡

　　流式细胞术细胞凋亡分析显示，5μmol/LGEM作用24h后，转染Plk-1基因的AsPC-1细胞出现明显的亚二倍体峰（图6），凋亡率明显低于未转染组及转染空载体组，其差异有高度统计学意义（P<0.01）；而空载体转染组与未转染组细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。

　　1：未加药+无转染组；2：未加药+转染空载体组；3：未加药+转染N1/Plk-1组；4：GEM+无转染组；5：GEM+转染空载体组；6：GEM+转染N1/Plk-1组；图中数据为凋亡率

　　图6GEM作用于各处理组AsPC-1细胞24h凋亡代表性

　　流式直方图

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