2.2 LC-MS/MS测定附子13种生物碱的含量

　　2.2.1 测定条件 液相条件：Agilent SB-C₁₈色谱柱（2.1 mm×20 mm，1.8 μm）;柱温35 ℃;流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液，B相为2 mmol·L^-1乙酸铵溶液+0.1%甲酸;流速0.4 mL·min^-1;进样量1 μL。梯度洗脱：0～1.5 min，15%～20% A;1.5～5 min，20% ～70% A;5～5.1 min，70% ～100% A;5.1～8 min，100% A。

　　质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子模式下进行数据采集，毛细管电压4 kV，干燥气温度350 ℃，干燥气流速11 L·min^-1，雾化气压力310 kPa。13种生物碱及内标的主要质谱分析参数见表1，上述条件下所测定各成分的MRM图见图1。

　　2.2.2 对照品溶液及内标溶液的制备 精密称取13种对照品适量，分别置于25 mL量瓶中，加0.05 mol·L^-1盐酸溶液溶解定容到刻度，配置成每1 mL含乌头碱、苯甲酰乌头原碱、次乌头原碱、附子灵、宋果灵、多根乌头碱、去甲猪毛菜碱0.5 mg，新乌头原碱0.25 mg，乌头原碱0.05 mg，新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱1 mg的单标储备溶液。取各单标储备溶液1 mL至25 mL量瓶中，用0.05 mol·L^-1盐酸溶液定容到刻度，得混合对照品储备溶液。

　　精密称取氢溴酸高乌甲素对照品适量，用甲醇配制成质量浓度约为25 mg·L^-1的内标溶液。

　　2.2.3 供试品溶液的制备 取各样品粉未（过3号筛）约2 g，精密称定，精密加入0.05 mol·L^-1盐酸溶液50 mL，摇匀，超声提取30 min，冷却至室温，3 000 r·min^-1离心10 min，取上清液0.4 mL置10 mL量瓶中，加1 mL内标溶液，再加甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

　　2.2.4 线性关系及检出限、定量限 取上述混合对照品储备溶液，精确配制一系列不同质量浓度的混合对照品工作溶液，每个浓度各加入1 mL内标溶液，加甲醇定容至10 mL，即得。按2.2.1项下条件测定，以对照品进样量与内标进样量之比为横坐标，对照品峰面积与内标峰面积之比为纵坐标绘制标准曲线。最小浓度对照品工作溶液逐级稀释进样，以信噪比S/N为3∶1确定最低检出限，以信噪比S/N为10∶1确定定量限，结果见表2。

　　由表2和图1可知，13种生物碱在上述线性范围内线性关系良好，无干扰，仪器检出限及定量限能达到样品含量测定要求。

　　2.2.5 精密度试验 取生附片供试品溶液，重复进样6次，记录峰面积。结果去甲猪毛菜碱、新乌头原碱、多根乌头碱、乌头原碱、宋果灵、次乌头原碱、附子灵、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱定量离子峰与氢溴酸高乌甲素定量离子峰面积比值的RSD分别为1.9%，2.8%，1.6%，2.3%，1.8%，2.7%，0.80%，1.1%，2.0%，0.70%，1.2%，1.6%，1.4%，表明仪器精密度良好。

　　2.2.6 稳定性试验 取生附片供试品溶液，室温放置0，1，2，4，8，10，12，24 h后，按上述测定条件测定，记录峰面积。结果上述13种生物碱定量离子峰与氢溴酸高乌甲素定量离子峰面积比值的RSD依次为2.3%， 3.6%，1.8%，2.9%，2.2%，2.9%，1.3%，1.5%，2.3%，1.9%，1.8%，2.0%，1.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

　　2.2.7 重复性试验 取生附片约2 g，共6份，精密称定，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，精密吸取1 μL，注入液质联用仪，记录峰面积，计算含量。上述13种生物碱含量的RSD依次为3.1%，3.4%，1.5%，3.8%，2.0%，2.9%，1.4%，1.0%，2.1%，1.9%，1.2%，1.7%，1.7%，表明重复性良好。

　　2.2.8 回收率试验 取已知含量的生附片1 g，精密称定，共6份，准确加入与样品中含量相当的对照品溶液，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，测定，记录峰面积，计算回收率。结果上述13种生物碱平均回收率依次为86.4%，96.6%，95.3%，96.4%，94.9%，93.2%，99.0%，95.1%，98.9%，95.6%，94.2%，101%，96.2%，RSD分别为0.90%，1.3%，1.8%，4.4%，1.2%，1.9%，1.7%，3.3%，4.2%，2.6%，1.5%，1.0%，2.6%。

　　2.2.9 含量测定 取各附片样品，按2.2.3项下方法操作，每个批次样品制备3份供试品，进样，测定峰面积，内标法计算，结果见表3，4。

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