[摘要] 目的 应用iTRAQ技术分析绝经前后三阴性乳腺癌组织差异蛋白的表达情况，旨在探讨绝经对三阴性乳腺癌发生的影响。 方法 选择绝经前及绝经后各8例经病理确诊的三阴性乳腺癌患者，应用iTRAQ技术分析差异蛋白显著性功能、差异蛋白pathway并进行差异蛋白验证。 结果 （1）绝经前差异蛋白相互作用组较集中，而绝经后的差异蛋白较多，且分布较散。（2）绝经前癌组织的差异蛋白存在于5种差异显著途径中；绝经后癌组织的差异蛋白存在于15种差异显著途径中。（3）与癌旁组织相比，绝经前共有214种显著差异蛋白，绝经后共有360种显著差异蛋白。绝经前的三阴性乳腺癌组织中上调蛋白81种，下调蛋白133种，绝经后上调蛋白157种类，下调203种。 结论 利用iTRAQ技术发现，绝经前后三阴性乳腺癌患者差异蛋白表达具有一定的特殊性，说明不同雌激素环境下三阴性乳腺癌可能存在不同发病机制，可能成为治疗TNBC的新靶点。
　　[关键词] 三阴性乳腺癌；绝经前后； iTRAQ技术；差异蛋白
　　[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）02-0001-04
　　三阴性乳腺癌（TNBC）是指孕激素受体（progesterone receptor，PR）、雌激素受体（estrogen receptor，ER）和人类表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）均为阴性表达的乳腺癌，其多发于初潮及足月怀孕年龄早、哺乳期短，特别是绝经前的妇女[1]。目前手术、化疗及新辅助化疗和靶向治疗为常用治疗TNBC方法。其中分子靶向治疗以肿瘤细胞的特征性改变为作用靶点，在发挥更强的抗肿瘤作用的同时减少对正常细胞的毒副作用。目前TNBC治疗靶点的筛查工作已取得了一定的研究进展，其中差异蛋白质组学的方法被认为是目前筛选TNBC临床治疗靶点最为有效的研究方法之一。差异蛋白质组学的方法主要包括双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、高效液相色谱技术、应用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术等分离技术及质谱鉴定技术[2]。近年来人们对iTRAQ技术的应用日渐开展起来，然而将iTRAQ技术应用于三阴性乳腺癌机制研究及靶向位点的探讨至今仍较少。本研究以绝经前和绝经后三阴性乳腺癌患者癌组织和癌旁正常组织为实验材料，利用iTRAQ技术分析绝经前和绝经后三阴性乳腺癌和癌旁正常组织蛋白差异表达谱，进而分析绝经前和绝经后差异蛋白的特异性，旨在探讨绝经对三阴性乳腺癌发生产生的影响，从而为三阴性乳腺癌的治疗提供依据。
　　1 资料与方法
　　1.1 临床资料
　　选择2013年1月～2014年1月间我院收治的绝经前及绝经后各8例经病理确诊的三阴性乳腺癌患者，病理类型均为导管腺癌。绝经前8例TNBC患者的年龄范围为40～53岁。绝经后8例TNBC患者的年龄范围为59～81岁。16例三阴性乳腺癌患者的病例资料见表1。
　　1.2 实验过程
　　1.2.1 SDS-PAGE （1）组织标本处理：取术后新鲜的乳腺癌组织及距肿瘤5 cm以上的癌旁正常乳腺组织，切成小块，称重，分装，置-80℃的低温冰箱中保存备用。（2）总蛋白制备：①取50 μg低温冷冻的样品置于液氮预冷的研钵中，边加入液氮边研磨，直至样品呈现白色粉末状，收集到1.5 mL的EP管中。②加入500 μL LS，振荡器混匀，超声波破碎，重复3次，每次间隔3 min。③置冰上1 h，并间歇震荡。④4℃，15 000 rpm离心30 min，重复2次，样品分层后用移液器小心地将中层清液吸出放入1.5 mL EP管中。⑤向中清液加入丙酮/甲醛沉淀液，冰上沉淀2 h。⑥4℃，15 000 rpm离心20 min，弃上清，加入1 mL 100%丙酮，置于-20℃冰箱中沉淀1 h。⑦加入80%丙酮1 mL，-20℃冰箱中沉淀1 h，4℃，15 000 rpm离心15 min，留取沉淀，在空气中晾干。⑧将250 μL 加入RS晾干沉淀，涡旋振荡器上混匀，30℃金属浴中孵育1 h。⑨4℃，15 000 rpm离心10 min，留取上清，即为组织总蛋白溶液。（3）总蛋白浓度测定：①准备两组8个1.5 mL离心管，每管各加入0、5、7.5、10、12.5、15、17.5和20 μL 0.5 mg/mL牛血清白蛋白，再分别加入20、15、12.5、10、 7.5、5、2.5、0 μL蛋白溶解液，再加入80 μL 0.15 mmol/L NaCl，以1号管不含牛血清白蛋白的作空白对照。②每管各加入1 mL考马斯亮蓝染料溶液。③比色测OD595。（4）SDS-PAGE：①准备SDS-PAGE凝胶。②将样品与SDS样品缓冲液混合，同样准备蛋白质分子量标准物。③上样：取15 μL蛋白样品上样，12% SDS-PAGE电泳，电极缓冲液为Tris-甘氨酸电泳缓冲液。按次序上样，一定安排已知分子量的标准物。④电泳。⑤取下凝胶，考马斯亮蓝或银染色染色观察分析。
　　1.2.2 酶解及iTRAQ标记 （1）样品处理：每组取120 μg样品于30 μL SDT溶液，沸水浴5 min，冷却至室温。加入200 μL UA溶液混匀，转入30 kd超滤离心管，离心14000 g 15 min。加入200 μL UA溶液，离心14000 g 15 min，弃滤液。加入100 μL IAA，600 rpm振荡1 min，避光室温30 min，离心14000 g 10 min。加入100 μL UA溶液，离心14000 g 10 min重复2次。加入100 μL 25 mM NH4HCO3，离心14000 g 10 min重复2次。加入40 μL Trypsin buffer 600 rpm振荡1 min，37℃ 16～18 h。换新收集管，离心14000 g 10 min，收集滤液。（2）蛋白质含量测定：同1.2.1。（3）同位素标记：从每组取等量肽段（约100 μg），按照试剂盒说明书进行标记。
　　1.2.3 肽段的分离及鉴定 分别进行强阳离子交换层析分级分离、毛细管高效液相色谱分离、ESI质谱鉴定。

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