1.3 数据分析及处理
　　（1）质谱数据分析：原始文件用iTRAQ Result Multiple File Distiller分析定量数据，并用Sequest软件鉴定多肽分子。定量方法采用Identified iTRAQ Statistic Builder软件分析，依据同位素报告基因的相对含量进行蛋白质定量。（2）生物信息学分析：分析差异蛋白在Gene Ontology数据库中的分布状况，利用Cluster软件进行蛋白功能注释，基于KEGG数据库对差异蛋白基因进行通路注释，得到差异蛋白基因所参与的所有的通路，利用Fisher精确检验计算每个通路的显著性水平，并对多重假设检验的结果进行校正并获得误判率，从而筛选出差异基因参与的显著通路[3]。
　　2 结果
　　2.1 绝经前后的TNBC患者差异蛋白显著性功能分析
　　绝经前在已鉴定的差异量2倍以上的214种蛋白中，具有Go注释的有89种，其中12种蛋白参与小分子代谢，10种蛋白参与细胞粘附，7种参与炎症反应，7种参与调节基因表达。见封三图1。绝经后已鉴定的差异量2倍以上的360种蛋白中，具有Go注释的有156种，其中24种蛋白参与小分子代谢，12种蛋白参与细胞粘附，8种参与炎症反应，15种参与调节基因表达，12种具有信号转导功能，3种参与凋亡反应，17种发挥转运功能，20种参与血液凝固，2种参与细胞内蛋白代谢过程，见封三图2。将绝经前和绝经后显著差异蛋白整理绘制相互作用图谱，发现绝经前差异蛋白相互作用组较集中，而绝经后的差异蛋白较多，且分布较散。见封三图3、4。
　　2.2 绝经前后的TNBC患者差异蛋白Pathway分析
　　基于KEGG数据库对差异基因进行Pathway注释，得到差异基因所参与的所有途径。绝经前有ECM-受体相互作用、蛋白质消化吸收、肾素-血管紧张素系统、互补及凝固级联反应和聚集粘附这5种途径为差异基因显著参与的途径。绝经后具有15种特异的Pathway，差异蛋白参与的途径包括粘着斑、在内质网内的蛋白质加工、丙酮酸的新陈代谢、PPAR信号通路、谷胱甘肽新陈代谢、葡萄球菌感染、核糖体、糖酵解、糖异生、补体、苯丙氨酸代谢、吞噬作用等。
　　2.3 绝经前后的TNBC患者差异蛋白验证分析
　　采用iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白，并可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10 kD或大于200 kD的蛋白。结果显示，在绝经前后两组共鉴定1254种蛋白质，其中1243种有定量信息。选择表达量差异2倍以上的作为显著差异蛋白，与乳腺癌旁组织相比，绝经前（premenopause）共有214种显著差异蛋白，绝经后（Hpost-menopauseH）共有360种显著差异蛋白（表2）。
　　表2 绝经前后TNBC患者显著差异蛋白（与乳腺癌旁组织相比）（个）
　　3 讨论
　　三阴性乳腺癌其发病及致病机制比较复杂，激素环境一直被认为是TNBC致病潜在重要的影响因子之一[7]。经期是激素变化的显著阶段，绝经前与绝经后体内激素发生很大的变化，其中雌激素越多，绝经女性患某些乳腺癌的几率相对越大[4]。目前，尚无绝经与TNBC关系的研究报道，是否绝经对三阴性乳腺癌发生具有影响，绝经前后不同激素水平条件下三阴性乳腺癌发生的机制是否存在差异，至今未知。
　　三阴性乳腺癌的治疗目前还没有一个明确的、行之有效的靶向治疗单剂，其中分子靶向治疗是目前治疗癌症的有效手段，且TNBC的治疗靶点的筛查工作已取得了一定的研究进展，其中差异蛋白质组学的方法被认为目前筛选临床治疗靶点最为有效的研究方法之一[5]。差异蛋白质组学的方法主要包括双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、高效液相色谱技术、应用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术等分离技术及质谱鉴定技术。由于凝胶电泳仍具有低灵敏度、无法检测低丰度蛋白的局限，因此近期人们比较关注同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术的应用[6-8]。与凝胶为基础的定量方法比较，iTRAQ技术可捕获全蛋白、且无需凝胶电泳、同时可进行多样品分析，从而成为研究三阴性乳腺癌靶向位点的有力手段之一[9，10]。然而iTRAQ技术应用到三阴性乳腺癌机制研究及靶向位点的探索至今仍较少。iTRAQ技术是采用4种或8种同位素的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。Leroi D等[11]采用iTRAQ技术探讨子宫内膜癌的差异蛋白，并发现chaperonin 10，pyruvate kinase M1 or M2 isozyme，calgizzarin等9种蛋白可以作为潜在的靶向治疗位点。
　　本研究应用iTRAQ技术结合2D LC-MS/MS，在绝经前和绝经后两组中共鉴定1254种蛋白质，其中1243种有定量信息。选择表达量差异2倍以上的作为显著差异蛋白，与癌旁组织相比，绝经前共有214种显著差异蛋白，绝经后共有360种显著差异蛋白。其中与癌旁组织相比，绝经前的三阴性乳腺癌组织中上调蛋白81种，下调蛋白133种，绝经后上调蛋白157种类，下调203种，绝经前后差异蛋白表达并不完全一致，说明绝经前后TNBC患者的蛋白表达情况具有一定的差异性及特殊性。在这些差异表达的蛋白中，有一些功能尚不十分清楚，而有一些与肿瘤密切相关。且本研究将绝经前和绝经后显著差异蛋白整理绘制相互作用图谱（封三图3、4），结果显示，绝经前差异蛋白相互作用组较集中，而绝经后的差异蛋白较多，且分布较散。同时我们对绝经前后的TNBC患者差异蛋白的通路分析显示：绝经前癌组织的差异蛋白存在于5种差异显著途径中；绝经后癌组织的差异蛋白存在于15种差异显著途径中。绝经前后的TNBC患者共同存在的差异蛋白主要体现在三条显著途径，分别为ECM-受体相互作用途经、蛋白质消化吸收、肾素-血管紧张素系统，而绝经后也有独特的差异显著通路，推测以绝经为界限，绝经前和绝经后的TNBC具有不同的致病机制[12]。共同的通路是三阴性乳腺癌的共性致病调控途径，而绝经后仍存在12种调控途径，包括粘着斑、在内质网内的蛋白质加工、丙酮酸的新陈代谢、PPAR信号通路、谷胱甘肽新陈代谢、葡萄球菌感染、核糖体、糖酵解、糖异生、补体、苯丙氨酸代谢、吞噬作用等相关蛋白，具有一定特性，因此根据绝经前后致病机制的不同，可以选择不同的治疗方案，为针对性治疗三阴性乳腺癌指明方向。

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