摘要：通过已知基因EST序列设计对特异性引物，经过2轮有限稀释法稀释cDNA文库；利用特异性引物作为探针，从cDNA文库中筛选出目的克隆，最终获得目的基因的全长序列。在此基础上，建立一种以CR为基础，利用有限稀释法快速、有效筛选噬菌体cDNA文库、分离全长目的基因的技术体系。
　　关键词：有限稀释法；噬菌体；cDNA文库；CR
　　中图分类号： Q785文献标志码： A
　　文章编号：002-302（204）2-0026-03
　　基因克隆是基因工程和分子生物学研究的基础，随着2世纪生物技术的快速发展，基因克隆技术越来越多被广泛应用[-2]。976年，Hofstetter等通过杂交质粒的方法第一个成功构建cDNA文库[3]以来，cDNA文库构建和筛选日益成熟并普及，并成为基因克隆及功能基因组研究的基本技术[4-5]，是最普遍、最经典的克隆全长基因序列的基本方法之一。传统的筛库方法以标记核酸探针技术为基础，其优点在于准确性和灵敏度高，缺点是放射性标记探针容易造成污染且同位素半衰期短不稳定，非放射性标记探针以生物素和地高辛为基础，成本高且所需工作量大。以CR为基础筛选 cDNA 文库的方法具有快捷、灵敏等特点，备受广大科研工作者青睐，如杨晓明等以CR介导的cDNA文库矩阵排列法进行混合基因组文库筛选、瞿文全等建立SSS（subsection screening）筛选cDNA文库的方法、王志成等基于96孔板CR法筛选 cDNA 文库[6-8]，等等。本研究尝试构建一种以CR为基础，结合有限稀释法筛选cDNA文库的方法，在能够快速有效分离出目的基因的基础上，减少筛选cDNA文库的工作量。
　　材料与方法
　　材料
　　λ噬菌体cDNA文库筛选使用由新疆石河子大学生命科学学院构建并保存的中国美利奴羊混合组织cDNA文库，宿主菌株为XL-Blue MRF，hagemid Excision所用菌株为XLOLR，均含四环素抗性。cDNA 文库构建及宿主菌株来自ZA Express cDNA Synthesis Kit试剂盒，购自Stratagene公司。
　　2试剂
　　LB液体和固体培养基、LB broth with supplement、NZY Agar，NZY Top Agar、5×NZY Broth、SM溶液、卡那霉素、四环素，均购自索莱宝公司；ITG和X-Gal，购自科百奥公司；琼脂粉、琼脂糖、低熔点琼脂糖、MgSO4，均购自Amresco公司；其余分子生物学试剂均为国产。
　　3引物
　　利用GenBank中公布的绵羊[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]预测基因EST序列，用SeqMan软件对EST序列拼接去载体，获得目的序列。将确定好的[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]基因序列，利用比较基因组学方法，比对寻找3′和 5′-UTR区域内的高度保守序列，使用remier rimer 50软件和NCBI上rimer-Blast工具设计特异性引物，并提交北京华大基因生物工程技术服务有限公司合成。
　　4CR反应条件
　　采用天根2×Taq CR Master Mix试剂盒，CR反应体系为：0×CR buffer，25 μL；25 mmol/L MgCl2，20 μL；0 mmol/L dNTMix，05 μL；0 μmol/L 正、反向引物，各 μL；模板，2 μL；Taq酶， U；ddH2O，补至 25 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30次循环；72 ℃延伸8 min。CR反应结束，用%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外凝胶成像仪观察并照相保存。
　　5λ噬菌体cDNA文库筛选
　　λ噬菌体cDNA文库筛选流程见图。
　　5宿主菌的制备用接种环蘸取XL-Blue MRF′菌液在含有四环素终浓度为2 μg/mL的LB平板上划线，37 ℃过夜培养；用接种针在平板上挑取个单菌落，于20 mL LB broth with supplement中30 ℃、220 r/min振荡过夜培养；培养菌液 000 g离心5 min，弃上清，加入0 mmol/L MgSO4溶液将菌株细胞重悬稀释调至D600 nm值为06～0，4 ℃保存备用。XLOLR菌制备过程与XL-Blue MRF′相同。
　　52λ噬菌体cDNA目的基因确定取λ噬菌体cDNA扩增文库菌液2 μL进行CR检测。
　　53λ噬菌体cDNA扩增文库的第轮有限稀释筛选根据CR检测结果能够获得特异性条带，将此扩增文库菌液E管编号0；另取0只5 mL E管并编号～0号管，加入00 μL LB broth with supplement培养基，依次从各管中取00 μL培养菌液，反复吸打充分混匀，进行有限稀释；取有限稀释的各管菌液4 μL进行CR检测，如～0号管CR检测中～9号管有特异性条带，而0号管无，则选取9号管为最大稀释倍数的阳性管。[FL）]
　　[FK（W7][TZLtif][FK）]
　　[FL（2K2]

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