54最大稀释倍数阳性管的培养吸取最大稀释倍数的阳性管噬菌体cDNA扩增文库溶液4 μL与400 μL XL-Blue MRF′宿主菌混合均匀，37 ℃温育20 min；加入600 μL LB broth with supplement培养基混匀，37 ℃振荡培养0 h；取培养菌液2 μL进行CR检测。
　　55文库第2轮有限稀释筛选经CR检测有特异性条带，则将对应E管编号为a；另取0支5 mL E管各加入00 μL LB broth with supplement培养基，依次标号a～j，从培养过的最大稀释倍数阳性管取00 μL菌液加入到a号管，反复吸打充分混匀，进行有限稀释；将a～j稀释完成的菌液 37 ℃ 振荡培养0 h，取各管培养液2 μL进行CR检测，确定最大稀释倍数的阳性管；将最大稀释倍数的阳性管37 ℃继续振荡培养2 h，平均分装成2管，第管进一步进行有限稀释，验证阳性克隆的稳定性，验证完成，第2管用于噬菌体单板的挑取。
　　6阳性噬菌体斑的挑取
　　经过2轮有限稀释筛选，取最大稀释倍数的阳性管菌液2 μL与200 μL振荡过夜培养的XL-Blue MRF′菌液（D600 nm≈6）混合，并吸打均匀，于37 ℃温育20 min；将混合菌液加入到8 mL，温育在48 ℃的NZY Top Agar中，混合混匀后将NZY Top Agar混合液均匀地倒入预热的NZY Agar平板上超过20 min，至平板凝固；将凝固后的平板倒置于37 ℃温箱中培养7～8 h，直至长出清晰的噬菌斑；逐个从平板上挑取噬菌体单斑于500 μL LB broth with supplement培养基，室温条件下温育～2 h，噬菌体溶液进行CR检测，鉴定为阳性后进行hagemid Excision。
　　7hagemid Excision
　　在0 mL离心管中，加入50 μL混匀的噬菌体溶液，37 ℃ 温育5 min；在离心管中加入2 mL LB broth with supplement培养基，37 ℃、260 r/min振荡培养25～3 h；菌液 65～70 ℃ 热激20 min，以 000 g离心5 min，收集上清于无菌离心管中；取00 μL上清与200 μL XLOLR细胞吸打混匀，37 ℃ 温育5 min；加入40 μL 5×NZY Broth，37 ℃恒温培养箱培养45 min；加入5 μL 20% ITG和40 μL 25 mg/mL X-Gal充分混匀，取00 μL涂板在含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基上，倒置37 ℃培养过夜；用灭菌牙签挑取平板上白色单菌落进行CR鉴定，阳性单克隆经液体培养，送交北京华大基因生物工程技术服务有限公司测序。
　　2结果与分析
　　2引物的设计
　　设计引物为[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]-F：5′-AACCAAAGCTGTTGACAGATGAGAAC-3′；R：5′-GCGCTGCAGTCGACACTAGTGGATC-3′。
　　22λ噬菌体cDNA扩增文库目的基因的确定
　　取2 μL绵羊cDNA扩增文库38×08 FU/mL，利用[WTBX][STBX]TORAI[WTBZ][STBZ]引物进行CR检测，经%琼脂糖凝胶电泳与CR marker对比，绵羊cDNA扩增文库在 800 bp 具有特异性条带（图2），表明文库中含有目的基因。
　　[FK（W][TZL22tif][FK）]
　　23有限稀释CR法目的基因筛选
　　由图3可见，在第轮有限稀释筛选中，～0号管均有特异性条带，且条带亮度逐渐降低，说明～0号管中总的克隆种类呈指数降低，目的基因克隆数在减少；9～0号管特异性条带微弱，说明9～0管中含有目的基因克隆且克隆数很少，9～0号管为最大稀释倍数阳性克隆管。
　　对9～0号管进行富集培养，取培养菌液2 μL进行CR验[CM（25]证，结果由图4可见，9～0号均有明显的特异性条带，能[CM）]
　　[FK（W8][TZL33tif][FK）]
　　[FK（W0][TZL44tif][FK）]
　　够进行第2轮筛选。
　　取0号培养管菌液00 μL进行第2轮有限稀释，取菌液经CR检测，结果由图5可见，a～j均出现特异性条带，各稀释管中均包含目的基因克隆；a～f条带亮度均一，g～j条带亮度逐渐增加，表明阳性克隆数在增加。这是有限稀释法的优点，经过第轮和第2轮筛选，非阳性克隆在减少，阳性克隆数经过富集扩大培养后大量增加，能够有效地筛选含目的基因的阳性克隆。
　　[FK（W9][TZL55tif][FK）]
　　为进一步确定j号管能够进行hagemid Excision，对j号管进行有限稀释验证。由图6可见，在有限稀释的j号管 ～6 份检测样本中均有特异性条带，表明第2轮有限稀释能够进行hagemid Excision。
　　[FK（W9][TZL66tif][FK）]
　　24hagemid Excision
　　经过2轮有限稀释筛选，经hagemid Excision，随机挑取6个单克隆进行CR鉴定，结果由图7可见，4个单克隆有明显的特异性条带，鉴定为含有目的基因的单克隆，将单克隆菌液送交测序。
　　[FK（W0][TZL77tif][FK）]

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