用萤火虫荧光素酶基因（rd29A~?uc)转基因植物为材料，分离到两个拟南芥突变体1〇s5和1〇s6,这两个突 变体植物不能合成ABA，d29A、C〇r15a和C〇r47等的表达也比野生型低。遗传分析表明，os5是aba3的等位 基因,os6是abal的等位基因，而且,ABA与Ca2+~CaM信号系统共同执行抗寒信号的传导M。外源ABA的 抗寒性诱导作用已在棉花（Gossypium hirsutum)、首宿、油菜(Brassica campestris L.)、黄瓜（Cucumis sativus)、水 稻等植物中得到证实。低温锻炼和ABA处理都具有增强植物抗寒性的作用。目前，已发现有多种基因的表 达可为外源ABA所诱导，其中大多数基因在种子后熟期或植物器官对逆境胁迫反应时表达。喷施外源ABA, 水稻幼苗在低温胁迫下及回温恢复中SOD活性增强，但水稻幼苗SOD活性增加并非激活该酶而是促进了该 酶的再合成。
　　3.4.3蛋白质磷酸化
　　拟南芥fy 1基因编码肌醇多聚磷酸盐1^磷酸酶,能降解信号分子肌醇1,4,5-三磷酸盐（IP3),对冷信号 传递进行负调控。fyl突变体的IP3含量比野生型高,cor基因表达增强，抗寒性提高M。实验结果表明，低 温诱导细胞内的Ca2+量增加，从而激活CDPK,增强水稻（Oryza sativa L.)抗寒性、抗旱性的。用基因沉默技 术，可抑制分解CDPK的蛋白质磷酸酶2 C基因表达、促进冷诱导基因表达，提高转基因植物的低温锻炼水平128。
　　蛋白激酶催化蛋白质磷酸化，有蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶、蛋白质酪氨酸激酶和蛋白质组氨酸激酶3 类。越来越多的证据显示，蛋白激酶参与植物低温逆境信号传导。苜蓿促分裂原活化蛋白激酶（MAPK)基因 mapk14可被低温和干旱快速激活，它在接收由第二信使传导的多种细胞内集成信号中起关键作用。MAPK 级联系统包括3种蛋白激酶，即MAPK、MAPK激酶（MAPKK)和MAPK激酶激酶（MAPKKK)。首先， MAPKKK接受低温逆境刺激信号，由失活型转变为激活型，从而进一步激活MAPKK,激活型MAPKK又会进 -步使MAPK激活，向下传导信息。实验证实，MAPK级联系统在参与植物低温胁迫信号传导时，其信号传 导元件mRNA水平上升以提高相应蛋白含量，将外界胁迫信号级联放大29。此外,有些报道表明，在某些植 物中，对抗寒锻炼起作用的并非一类激素的绝对含量，而是与GAs -类激素的比例。因此，有人认为ABA/ GAs更反映出植物的抗寒性。
　　3.5不饱和脂肪酸酶基因的表达
　　Roughan在研究74种植物膜上的磷脂酰甘油（PG)脂肪酸组成与抗寒性之间的关系时发现，细胞膜脂肪 酸的不饱和度对植物抗寒性有很大影响，细胞膜脂的不饱和脂肪酸含量愈高，植物的抗寒性愈强。用脂质体 原生质体融合和基因转化技术，转化甘油-3^磷酸酰基转移酶基因和转w-3脂肪酸去饱和酶基因/ad2~8的水 稻植株,可以降低或增强转基因植株抗寒性。但拟南芥的另一个突变体fab1的PG饱和脂肪酸表达水平却提 高，植株的抗寒性也增强，显示PG饱和度并不是唯一影响植株抗寒性的因素，可能还有其他因子参与低温 调控。
　　膜脂降解与植物抗寒性关系的证据主要来源于对磷脂酶PLD的研究。PLD是催化膜脂分解的主要酶之 一。低温胁迫下,PLD介导的膜磷脂的分解得到强化。有学者将编码PLD和反义PLD的基因分别转人烟 草,转反义PLD转化株抗寒性获得提高，而转PLD转化株的抗寒性下降。无疑，不饱和脂肪酸,特别是某些膜 脂中的不饱和脂肪酸分子种（PG分子种）对植物抗寒性的形成具有重要的作用，而且通过对脂肪酸的去饱和 作用或抑制膜脂的降解进行遗传操作已证明可以改变植物对低温胁迫的敏感性61。膜脂脂肪酸的去饱和作 用是调节植物抗寒性的一个重要机制。
　　4基因工程改良植物抗寒性
　　1970年，科学家首次提出了植物在适应低温胁迫的过程中基因表达发生改变的观点。此后的研究发现，抗寒锻炼/冷锻炼能诱导和增强植物的一些基因的表达，使多种基因表达发生改变。目前，国内外的植物抗寒 基因工程主要是针对以上两类低温诱导基因加以展开的。
　　4.1导入抗寒调控基因
　　植物在感受和传导寒冷信号的过程中，有多种调控基因参与编码产生信号传递因子和调控蛋白，包括各 种转录因子和蛋白激酶，如DREB转录因子、细胞分裂蛋白激活激酶、14-3-3蛋白等。目前，有关导入抗寒调 控基因的研究主要围绕与抵抗寒冻所导致的渗透胁迫相关的低温诱导基因转录因子DREB展开M。研究发 现，植物在抵抗寒冻所造成的渗透胁迫过程中，有多种基因得以诱导表达，且多数在转录水平调节的低温诱 导基因和水分胁迫诱导基因的启动子区域有一个顺式（cis)作用元件TACCGA4AT是这些胁迫诱导基因表 达所必需的调控区，与低温胁迫调节信号的作用有关，被称为脱水反应因子DRE。还有一些低温诱导基因上 有两个顺式作用元件CRT/DRE,如转录因子CBF1能结合CRT/DRE元件，CBF4能结合CBF/DREB1元件， 从而诱导低温胁迫诱导基因和水分胁迫诱导基因的表达M。由于转录因子能诱导多种低温胁迫诱导基因和 其它逆境胁迫诱导基因的表达，因而，可在很大程度上增强植物抗寒性。利用农杆菌介导法将由诱导型启动 子rd29A调控的拟南芥转录因子CBF3基因导入烟草，获得Southern阳性转基因烟草，低温胁迫实验表明， CBF3转基因烟草幼苗获得了一定的抗寒能力，特别是可溶性糖、可溶性蛋白质和游离脯氨酸含量均较对照极显著提高M。
　　4.2导人抗寒功能基因 4.2.1导入抗渗透胁迫相关基因植物在抵抗寒冻所导致的渗透胁迫过程中，体内将积累大量糖类和脯氨酸等渗透调节物质，并有多种冷 调节蛋白得以诱导表达。这些调节蛋白含大量亲水性氨基酸,具有热稳定性，且多数具有重复的氨基酸序列 和相对简单的氨基酸组成,基因启动子区域含有DRE顺式作用元件。目前，研究较深入的是LEA蛋白基因 和COR家族蛋白的基因。使COR15am多肽在转基因拟南芥中大量表达后，与野生型相比，转基因植株叶绿 体和原生质体对寒冷耐受性提高,原生质膜稳定性增强，减轻了寒冻所造成的损伤3]。
　　4.2.2导入抗冻蛋白基因
　　对植物中抗冻蛋白（AFP)的研究较晚。Griffth等在世界上首次明确指出，冷锻炼的冬黑麦（Semfe cermle L.)中有内源AFP产生，此后，世界各地在多种植物中发现了 AFP,且植物中存在的AFP较较动物中更普遍, 是抗寒冻植物对冬季低温较为普遍的适应机制。这些抗冻蛋白都具有3个基本性质：1)热滞效应;2)冰晶形 态的修饰效应;3)抑制重结晶M。由于AFPs显著的抗冻调节作用，有关AFPs蛋白基因的转基因工程近年 来开展甚多。用真空透析法将冬比目鱼afp基因导入马铃薯、拟南芥和欧洲油菜中，降低了 3种植物的自然 结冰温度;用电击法将冬比目鱼afp基因导入玉米原生质体中获得了表达，提高了玉米抗寒性；用花粉管通道 和子房注射法将整合在Ti质粒上的美洲拟鲽afp基因导入番茄中，提高了番茄抗寒性B7]。但是，在已研究过 的绝大多数植物材料中，AFP活性大大低于鱼类和昆虫中的，所研究的植物虽多达几十种，真正可被分离纯化出来的AFP尚不多。

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